本发明专利技术涉及一种鸡体重性状基因诊断试剂盒及其应用，属于生物育种技术领域。本发明专利技术发现QPCTL基因启动子区域的两个分别为52bp和224bp的插入会造成鸡的不同体重的差异，这两种Indels可以作为鸡体重的遗传标记，针对52bp和224bp的插入这一特征，设计基因特异性引物P，PCR反应后进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果准确、快速、方便的检测鸡QPCTL基因启动子不同体重性状的基因型，选择出224bp的纯合插入的基因型个体，从而缩短育种时间，加快育种进程。本发明专利技术建立的分子生物学方法大大提高了基因型的判定效率和准确性，方法简单、易操作，且成本低。
A Kit for Gene Diagnosis of Chicken Weight Traits and Its Application
【技术实现步骤摘要】
一种鸡体重性状基因诊断试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种鸡体重性状基因诊断试剂盒及其应用，属于生物育种
技术介绍
Indel是指在近缘物种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生不同大小核苷酸片段的插入或缺失(insertion/deletion)，是同源序列比对产生空位(gap)的现象。Indel在基因组中分布广泛，在分布密度上仅次于单核苷酸多态性(SNP)，但远高于SSR。Indel多态性分子标记是基于插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增的标记，其本质仍属于长度多态性标记，可利用便捷的电泳平台进行分型。Indel标记准确性高、稳定性好，分型系统简单，开始应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种、医学诊断等研究领域。人类标记的检测已经成为基因诊断的重要手段，随着位于功能基因上indel标记的开发，结合染色体步移和基因精细定位，可将这些标记应用于农业动物经济性状的功能基因的筛选，有利于优良基因的进一步开发和利用。中国的地方鸡种生长速度较慢，一直是育种过程中面临的问题。国外商品肉鸡和蛋鸡的选育由来已久，其在控制生长的相关基因上是否与中国地方鸡种具有差异，目前研究还知之甚少。在地方鸡的育种中需要选育出生长速度快的基因型个体，来满足育种的需求。因此利用分子生物手段来诊断某个体与体重相关基因的基因型，这对育种来说是非常重要和必要的。体重是一种重要的数量性状，在鸡中具有高的遗传性，体重能直接反映营养摄入和支出的平衡，导致瘦肉或脂肪的沉积和骨骼肌的生长。随着家禽遗传标记辅助育种不断深入，大量的性状已经在遗传水平上确定了候选区域。我国有丰富的地方鸡品种资源，如何对其评估、保护和选育是迫切需要解决的问题。QPCTL(Glutaminylpeptidecyclotransferase-like)是QPCT的一种同工酶，QPCTL在人类的肥胖中具有一定的作用，而在家禽动物鸡中发现其在生长发育中可能扮演了重要作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鸡QPCTL基因启动子多态性标记的检测引物，该检测引物特异性强，对鸡QPCTL基因启动子多态性标记扩增效率高。本专利技术还提供了包含上述检测引物的检测试剂盒。本专利技术还提供了鸡QPCTL基因启动子多态性标记的应用。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种鸡QPCTL基因启动子多态性标记的检测引物，其特征在于：依据如SEQIDNO.1所示的序列设计，所述检测引物的扩增片段覆盖该序列5‘端起的第20-409位。该引物采用现有技术中常用的设计方法，也可以根据检测方法的不同进行设计。本专利技术的检测引物扩增出的多态性标记位于QPCTL基因的启动子部位。本专利技术中发现鸡不同体重的差异是由于QPCTL基因启动子区域的两个分别为52bp和224bp的插入造成的，这两个片段的插入/缺失构成具有三种基因型的复等位基因。这三种基因型分别为：基因型A是QPCTL基因启动子区52bp和224bp插入基因型，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，5‘端起第21-72位插入，第136-248位、268-362位和393-408位插入(由于这三个分别为112、96、和16bp的插入/缺失片段彼此相邻，而且在所有分型个体中保持一致，将其定义其为一个224bp大片段)；基因型B是QPCTL基因启动子区224bp插入和52bp缺失基因型，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；基因型C是QPCTL基因启动子区224bp缺失和52bp插入基因型，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，其中C基因型为GenBankNC_006119.3中的序列。目前人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有SNP、单链构象多态技术(SSCP)、PCR-RFLP和直接测序技术等，但SNP和SSCP操作繁琐；普通的PCR-RFLP方法要求待测多态性位点是某一特定酶切位点，应用范围局限；而直接测序技术成本较高。本专利技术的鸡QPCTL基因启动子多态性标记，仅通过常规PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳即可分型。具体的，所述引物序列如下所示：上游引物P-F：5’-CTGGAATGAGCCCACATCCG-3’；下游引物P-R：5’-CACCCGACGGGATGTTATCG-3’。鸡为二倍体动物，通过上述的A、B、C三种基因型自由组合可以得到AA基因型、BB基因型、CC基因型、AB基因型、BC基因型、AC基因型，可通过上述引物进行PCR扩增，检测扩增产物判断基因型。选择第136-248位、268-362位和393-408位三个片段纯合缺失的鸡个体，即为选出AA基因型、BB基因型、AB基因型的鸡个体，淘汰其他基因型的个体。包含上述检测引物的检测试剂盒。具体的，还包括dNTPs、PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和DNAMarker中的一种或几种。本专利技术通过对其他鸡群体进行判型，并测序验证了上述检测引物的准确性。研究表明本专利技术的检测引物能有效地判断不同体重性状的基因型，可以用于鸡的生长性状的分子标记辅助选择，进而建立纯合优势基因型的鸡种群。鸡QPCTL基因启动子多态性标记在鸡体重性状选育中的应用，所述多态性标记如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示，这三种标记在鸡同源染色体上形成复等位基因，分别对应A、B、C等位基因型。具体的，检测如SEQIDNO.1所示序列5‘端起第21-72位、第136-248位、268-362位和393-408位是缺失或插入，选择第136-248位、268-362位和393-408位三个片段双染色体插入的鸡个体(AA、BB、AB基因型)，淘汰第136-248位、268-362位和393-408位三个片段双染色体缺失(CC基因型)或者单染色体缺失基因型的鸡个体(AC、BC基因型)。本专利技术的新发现的多态性标记可用于鸡的辅助选择和分子育种，有助于节省生产成本并加快遗传选育进展，具有很大的经济应用价值和科研价值。并且对于该多态性标记的52bp和224bp插入缺失基因片段来说，常规PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳即可分型，根据琼脂糖凝胶电泳结果可以准确、快速、方便的检测QPCTL基因不同体重性状基因型。本专利技术中可通过PCR扩增检测第136-248位、268-362位和393-408位是缺失或插入，所述PCR扩增时使用的引物如下所示：上游引物P-F：5’-CTGGAATGAGCCCACATCCG-3’；下游引物P-R：5’-CACCCGACGGGATGTTATCG-3’。所述PCR扩增的反应体系为：2×TaqPCRMasterMix5.0μL，ddH2O3.0μL，引物P-F0.5μL，引物P-R0.5μL，DNA模板1.0μL。所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。所述DNA模板可采用苯酚-氯仿粗提法或蛋白酶K法提取。通过观察所述PCR扩增的产物条带大小检测所述第136-248位、268-362位和393-408位是否插入。其中A基因型的扩增片段为469bp，B基因型的扩增片段为417bp，C基因型的扩增片段为245bp，通过琼脂糖凝胶电泳即可分型，不需要酶切。AA基因型表现为469bp条带本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种鸡QPCTL基因启动子多态性标记的检测引物，其特征在于：依据如SEQ ID NO.1所示的序列设计，所述检测引物的扩增片段覆盖该序列5‘端起的第20‑409位。
【技术特征摘要】
1.一种鸡QPCTL基因启动子多态性标记的检测引物，其特征在于：依据如SEQIDNO.1所示的序列设计，所述检测引物的扩增片段覆盖该序列5‘端起的第20-409位。2.根据权利要求1所述的检测引物，其特征在于：所述引物序列如下所示：上游引物P-F：5’-CTGGAATGAGCCCACATCCG-3’；下游引物P-R：5’-CACCCGACGGGATGTTATCG-3’。3.包含如权利要求1或2所述检测引物的检测试剂盒。4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于：还包括dNTPs、PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和DNAMarker中的一种或几种。5.鸡QPCTL基因启动子多态性标记在鸡体重性状选育中的应用，其特征在于：所述多态性标记如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示，这三种标记在鸡同源染色体上形成复等位基因，分别对应A、B、C等位基因型。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：检测如SEQIDNO.1所示序列5‘端起第136-248位、268-362位和393-408位是缺失或插入，选择第136-248位、268-362位和393-408位三个片段双染色体插入的鸡个体，淘汰第1...
【专利技术属性】
技术研发人员：李转见，李文雅，韩瑞丽，康相涛，田亚东，任团辉，李东华，孙桂荣，闫峰宾，蒋瑞瑞，李红，李国喜，刘小军，陈悦，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41
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