本发明专利技术公开了一种检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因突变的引物组、试剂盒及使用方法，提供5个基因的49个用于评估人类罹患肺癌风险的特异性和敏感性的基因变异位点，利用MassARRAY核酸质谱技术对这些位点进行基因分析检测。本试剂盒单碱基延伸时只加入用于延伸突变型基因的ddNTPs，并且ddNTPs带有生物素标记，使用带有链霉亲和素标记的磁珠对延伸产物进行捕获，去除杂峰的信号干扰，大大增加延伸产物中突变型基因的信号值，提高试剂盒的灵敏度。应用本方法检测循环肿瘤DNA样本，20ng上样量其灵敏度可低至0.1％。此方法相较qPCR及二代测序平台，具有设计灵活、准确性高、成本低、操作简便等优势。
Detection of lung cancer-related gene mutations in human circulating tumor DNA by primers, kits and methods of use
【技术实现步骤摘要】
检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因突变的引物组、试剂盒及使用方法
本专利技术属于基因检测领域，尤其是涉及一种检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因突变的引物组、试剂盒及使用方法，利用多重PCR技术、单碱基延伸技术和核酸质谱技术，对肺癌相关的5个基因49个位点进行基因检测。
技术介绍
肿瘤是多基因经历多步骤变化导致细胞周期紊乱，使细胞失控性生长而形成的新生长物。肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)占肺癌的85％左右，NSCLC中又以腺癌最常见。在肿瘤学、遗传学等多学科研究中发现，大多数NSCLC患者存在表皮生长因子受体(EpidermalGrowthFactorReceptor，EGFR)等原癌基因和抑癌基因的突变，它们在肿瘤的形成及其介导瘤细胞的生物行为中发挥着重要的作用，因此这些基因成为抗肿瘤靶向治疗药物的重要靶点之一。癌症临床治疗的有效率目前仍然偏低，这与癌症复杂的发生机理和患者个体化差异密切相关。随着人类基因组学、药物基因组学及癌症分子生物学研究的不断深入和发展，研究表明人体中某些基因与癌症的靶向或化疗药物的疗效或毒性是密切相关的，对这些特定基因进行检测，简单的说就是取被检测者的组织细胞、血液或胸腔积液，经提取和纯化其基因信息后，通过特定设备对被检测者细胞中的特定基因作检测，分析基因的状态为癌症患者提供治疗方案参考更具科学性，有助于提高患者的生活质量和生存期，并节省患者的时间和金钱。有研究表明，肿瘤患者的血液、胸腹腔积液、脑脊液等体液中可以检测到的游离DNA含量远大于正常人，并且游离DNA表现出与肿瘤组织相同的生物学特性。随着肿瘤分子生物学研究的进展，游离DNA的检测及其生物学指标的研究已为临床肿瘤早期诊断、预后判断及跟踪随访等提供一系列方便、快捷、特意、无创或微创的分子生物学检测手段。核酸质谱检测技术联合PCR技术、单碱基延伸技术，通过PCR扩增技术放大检测样本模板量；利用具有“微测序”之称的单碱基延伸技术特异性延伸一个碱基，准确性极高；尤其是质谱检测目标为物质的分子量，无需荧光探针标记，识别单碱基之间的差异时分辨率高达9Da，使得该技术在基因检测领域具有非常旺盛的生命力。该技术自2002年荣获诺贝尔奖以来，受到各界广泛关注，在医学、农业等各大领域已有众多应用。
技术实现思路
本专利技术提供了一组检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因变异的引物组。本专利技术的另一个目的是提供一种检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因变异试剂盒，该试剂盒可以同时检测多个突变位点，通量高。检测时间较短，单个位点的费用相对较低。本专利技术的第三个目的是提供一种检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因变异的试剂盒的使用方法。分析灵敏度和分析特异性好，操作简便。与普通核酸质谱检测产品不同的是，本试剂盒单碱基延伸时只加入用于延伸突变型基因的ddNTPs，并且ddNTPs带有生物素标记，使用带有链霉亲和素标记的磁珠对延伸产物进行捕获，去除杂峰的信号干扰，从而大大增加了延伸产物中突变型基因的信号值，提高了试剂盒的灵敏度。应用本方法检测循环肿瘤DNA样本，20ng上样量其灵敏度可低至0.1％。此方法相较qPCR及二代测序平台，具有设计灵活、准确性高、成本低、操作简便等优势。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因突变的引物组，引物组包括PCR扩增引物、单碱基延伸引物和过程质控引物，PCR扩增引物序列为SEQIDNo.1-22，单碱基延伸引物序列为：SEQIDNo.23-62，过程质控引物序列为：SEQIDNo.63-65。所述单碱基延伸引物分为8组：一种检测人类肺癌相关基因突变的试剂盒，包括：1)用于PCR的反应试剂，包括SEQIDNo.1-22所述PCR扩增引物，SEQIDNo.63-64所述过程质控引物，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，MgCl2，PCR反应缓冲液；2)用于PCR产物纯化的试剂，包括虾碱性磷酸酶，虾碱性磷酸酶缓冲液；3)用于单碱基延伸的试剂，包括SEQIDNo.23-62的单碱基延伸引物，SEQIDNo.65的过程质控引物，耐高温的单碱基延伸酶，生物素标记ddNTPs，延伸反应缓冲液。4)用于延伸产物捕获的试剂，包括链霉亲和素标记的磁珠，结合/洗涤缓冲液。试剂盒还包括：阴性质控品，阳性质控品，捕获质控品，纯化用树脂，点样及质谱检测用的靶板。用来评估人类罹患肺癌风险的特异性和敏感性的基因突变位点为：BRAF_p.D594G、BRAF_p.G469A、BRAF_p.G469V、BRAF_p.V600E、EGFR_p.C797S、EGFR_p.D770_N771insSVD、EGFR_p.D770_N771insG、EGFR_p.E709A、EGFR_p.E709G、EGFR_p.E709K、EGFR_p.E746_A750del、EGFR_p.E746_E749del、EGFR_p.E746_S752＞D、EGFR_p.E746_S752＞V、EGFR_p.E746_T751del、EGFR_p.G719A、EGFR_p.G719C、EGFR_p.G719S、EGFR_p.H773_V774insNPH、EGFR_p.H773_V774insH、EGFR_p.L747_A750＞P、EGFR_p.L747_E749del、EGFR_p.L747_P753＞S、EGFR_p.L858R、EGFR_p.L861Q、EGFR_p.L861R、EGFR_p.S768I、EGFR_p.T790M、EGFR_p.V769_D770insASV、ERBB2_p.A775_G776insYVMA、ERBB2_p.G776＞VC、KRAS_p.G12A、KRAS_p.G12V、KRAS_p.G12D、KRAS_p.G12R、KRAS_p.G12C、KRAS_p.G12S、KRAS_p.G13C、KRAS_p.G13D、KRAS_p.Q61H、KRAS_p.Q61K、KRAS_p.Q61E、KRAS_p.Q61P、KRAS_p.Q61L、KRAS_p.Q61R、PIK3CA_p.E542K、PIK3CA_p.E545K、PIK3CA_p.H1047L、PIK3CA_p.H1047R。上述检测人类肺癌相关基因突变的试剂盒的使用方法，包括如下步骤:1)多重PCR反应：在一个反应体系内，以待测样本DNA为模板，使用特异性的针对包含所检测基因突变位点的PCR扩增引物，通过多重PCR同时扩增含有不同待检基因位点的序列，得到含扩增目标区域的PCR产物；2)利用虾碱性磷酸化酶消化步骤1)反应体系中剩余的dNTPs；3)利用单碱基延伸引物对步骤2)消化后的产物进行单碱基延伸反应，获得延伸产物；4)利用链霉亲和素标记的磁珠捕获单碱基延伸产物中突变型的延伸产物；5)利用MassARRAY平台进行树脂纯化、芯片点样、质谱检测，结果使用TYPER4.0软件分析并输出结果，通过变异碱基处是否出峰来判断突变类型。所述步骤1)的PCR反应条件为：95℃、2min；95℃、30s，56℃、30s，72℃、1min，45个循环；72℃、5min；4℃保本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因突变的引物组，其特征在于，引物组包括PCR扩增引物、单碱基延伸引物和过程质控引物，PCR扩增引物序列为SEQ ID No.1‑22，单碱基延伸引物序列为：SEQ ID No.23‑62，过程质控引物序列为：SEQ ID No.63‑65。
【技术特征摘要】
1.一种检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因突变的引物组，其特征在于，引物组包括PCR扩增引物、单碱基延伸引物和过程质控引物，PCR扩增引物序列为SEQIDNo.1-22，单碱基延伸引物序列为：SEQIDNo.23-62，过程质控引物序列为：SEQIDNo.63-65。2.根据权利要求1所述检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因突变的引物组，其特征在于，所述单碱基延伸引物分为8组：3.一种检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因突变的试剂盒，其特征在于，包括：1)用于PCR的反应试剂，包括权利要求1所述PCR扩增引物，过程质控引物，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，MgCl2，PCR反应缓冲液；2)用于PCR产物纯化的试剂，包括虾碱性磷酸酶，虾碱性磷酸酶缓冲液；3)用于单碱基延伸的试剂，包括权利要求1或2所述的单碱基延伸引物，过程质控引物，耐高温的单碱基延伸酶，生物素标记的ddNTPs，延伸反应缓冲液；4)用于延伸产物捕获的试剂，包括链霉亲和素标记的磁珠，结合/洗涤缓冲液。4.根据权利要求3所述检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因突变的试剂盒，其特征在于，试剂盒还包括：阴性质控品，阳性质控品，捕获质控品，纯化用树脂，点样及质谱检测用的靶板。5.根据权利要求3所述检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因突变的试剂盒，其特征在于，用来评估人类罹患肺癌风险的特异性和敏感性的基因突变位点为：BRAF_p.D594G、BRAF_p.G469A、BRAF_p.G469V、BRAF_p.V600E、EGFR_p.C797S、EGFR_p.D770_N771insSVD、EGFR_p.D770_N771insG、EGFR_p.E709A、EGFR_p.E709G、EGFR_p.E709K、EGFR_p.E746_A750del、EGFR_p.E746_E749del、EGFR_p.E746_S752＞D、EGFR_p.E746_S752＞V、EGFR_p.E746_T751del、EGFR_p.G719A、EGFR_p.G719C、EGFR_p.G719S、EGFR_p.H773_V774insNPH、EGFR_p.H773_V774insH、EGFR_p.L747_A750＞P、EGFR_p.L747_E749del、EGFR_p.L747_P753＞S、EGFR_p.L858R、EG...
【专利技术属性】
技术研发人员：李同恩，孟庆艳，陈兴京，杨俊红，张振宇，朱兵，张双华，贾鑫哲，崔斌，刘宇飞，
申请(专利权)人：中源协和天津医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12
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