一种监测miRNA动态变化的报告基因及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种监测miRNA动态变化的报告基因及其制备方法，所述的报告基因包括PUF基因、质粒psiCHECK‑2‑HM471G、Fluc基因、与目的miRNA完全互补配对的四段串联重复序列和与PUF完全互补配对的六段NRE串联重复序列，所述的与目的miRNA完全互补配对的四段串联重复序列位于PUF蛋白的终止密码子TGA下游，所述的与PUF完全互补配对的六段NRE串联重复序列位于Fluc基因起始密码子ATG上游。该报告基因以对神经分化过程中或肌肉、心肌分化过程中产生的特异性miRNA进行实时、定量的监控。

A Reporter Gene for Monitoring the Dynamic Change of MicroRNA and Its Preparation Method

【技术实现步骤摘要】
一种监测miRNA动态变化的报告基因及其制备方法
本专利技术属于分子生物学和基因工程
，具体涉及一种监测miRNA动态变化的报告基因及其制备方法。
技术介绍
MicroRNAs(miRNA，miR)是由20到22个非编码核苷酸组成的小分子单链RNA，可通过抑制翻译或降解mRNA来调控基因的表达。这些分子与许多细胞的活动，诸如分化分生，增殖凋亡有着密切关系。又因其可诱导特定mRNA降解或抑制翻译，所以在很多临床上重要的疾病中也发挥着重要的作用。一些miRNAs已经被证实与心肌以及肌肉的分化过程有关，如miR-1，miR-133，miR-181，miR-195，miR-206，andmiR-26a。还有些miRNAs被发现与神经分化进程有着密切关系，例如miR-9，miR-124等。目前用于监控miRNAs表达的传统手段主要有Northern杂交(Northernblot)、基因芯片(microarray)、实时定量PCR(real-timepolymerasechainreaction)技术等。通过传统手段，并不能将细胞活动过程内动态miRNA的表达变化得以完全以及可重复性地表现出来。而且这些传统技术在监测过程中大多要求破坏生物组织，导致细胞水平的裂解或死亡，既耗费时间精力，又不能在活体水平加以检测。目前主要用的分子成像发光手段包括生物荧光与自发荧光两方面。运用了分子信标、放射性同位素标记、报告基因系统等手段。分子信标面临的问题主要是所带显色基团是否足够稳定，在不发生结合时荧光淬灭能力极其本身所带的背景荧光值过高；而放射性同位素则会对生物体造成一定程度的损伤；存在的报告基因系统为switch-Off系统，不能确定是随着时间的流逝所造成的荧光表达下降还是报告基因系统的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种无创、实时在体检测miRNA表达水平的报告基因及其构建方法，实现对神经分化过程或肌肉分化过程中相关miRNA的动态监控。为深入研究对相关神经疾病模型或肌肉萎缩疾病中，分子表达水平对其所产生的调控奠定基础。为了实现上述技术效果，本专利技术具体通过以下技术方案实现：一种监测miRNA动态变化的报告基因，所述的报告基因包括PUF基因、质粒psiCHECK-2-HM471G、Fluc基因、与目的miRNA完全互补配对的四段串联重复序列和与PUF完全互补配对的六段NRE串联重复序列，所述的与目的miRNA完全互补配对的四段串联重复序列位于PUF蛋白的终止密码子TGA下游，所述的与PUF完全互补配对的六段NRE串联重复序列位于Fluc基因起始密码子ATG上游。本专利技术所述的报告基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术提供了所述的监测miRNA动态变化的报告基因的制备方法，包括以下步骤：1)将PUF基因克隆到质粒psiCHECK-2-HM471G多克隆位点上，得到质粒psiCHECK-2-HM471G-PUF；2)将Fluc基因克隆到psiCHECK2-HM471G上，获得psiCHECK2-HM471G-Fluc；3)利用miRNA与靶标通过碱基互补配对的形式相互作用，将与目的miRNA完全互补配对的四段串联重复序列克隆到上，获得psiCHECK-2-HM471G-PUF-miR-Fluc；4)利用PUF蛋白与NRE通过碱基互补配对的形式相互作用，将与PUF完全互补配对的六段NRE串联重复序列克隆到上，获得报告基因psiCHECK-2-HM471G-PUF-miRreporter。所述的所述的与目的miRNA完全互补配对的四段串联重复序列位于PUF蛋白的终止密码子TGA下游。所述的与PUF完全互补配对的六段NRE串联重复序列位于Fluc基因起始密码子ATG上游。在本专利技术的另一方面，提供了所述的报告基因在检测分化过程中miRNA动态变化的应用。所述的分化过程包括神经分化和肌肉分化。所述的应用的具体过程为：所述的报告基因在体内首先经过转录，翻译成为一条线性的肽链，能够同时表达PUF和Fluc这两个基因，分别受不同启动子的调控；当细胞中不存在目的miRNA时，PUF会结合到6xNRE序列上，从而抑制Fluc的表达，细胞中荧光素酶含量低；当细胞中存在目的miRNA时，目的miRNA会结合到4xmiR靶序列上，抑制PUF的表达，从而解除对Fluc的抑制，使Fluc表达，产生可以检测的荧光信号。本专利技术的有益效果为：本专利技术的报告基因系统，可以对神经分化过程中或肌肉、心肌分化过程中产生的特异性miRNA进行实时、定量的监控。作为一个正向的监测系统，本身不会因时间的变化发生衰弱，所以可以长效、无创地实现在体检测。这对临床深入探索相关神经方面疾病或是肌肉萎缩疾病有着十分重要的意义。附图说明图1是本专利技术报告基因的结构图；图2是体外模拟诱导测定荧光强度；图3是细胞内神经分化测定荧光强度；图4是细胞内肌肉分化测定荧光强度。具体实施方式下面将结合本专利技术具体的实施例，对本专利技术技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1报告基因的构建本实施例提供了一种监测miRNA动态变化的报告基因，该报告基因通过以下方法得到：(1)利用PUF能与靶序列结合抑制荧光表达而作为报告基因应用于体系中，将PUF基因克隆到质粒psiCHECK-2-HM471G多克隆位点上，从而得到质粒psiCHECK-2-HM471G-PUF；(2)利用萤火虫荧光素酶可以作为报告基因生物发光的特性，将Fluc基因克隆到psiCHECK2-HM471G上，从而获得psiCHECK2-HM471G-Fluc；(3)利用miRNA与靶标通过碱基互补配对的形式相互作用，将与目的miRNA完全互补配对的四段串联重复序列克隆到上，并位于PUF蛋白的终止密码子TGA下游，获得psiCHECK-2-HM471G-PUF-miR-Fluc；(4)利用PUF蛋白与NRE通过碱基互补配对的形式相互作用，将与PUF完全互补配对的六段NRE串联重复序列克隆到上，并放在Fluc基因起始密码子ATG上游。从而获得报告基因psiCHECK-2-HM471G-PUF-miRreporter(图1)。具体的其构建方法为：1)线性化载体psiCHECK-2-HM471G经过限制性内切酶Nhe1和Xho1双酶切，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下切下目的DNA片段。目的条带用胶回收试剂盒回收纯化。2)获得插入片段：PUF序列，4xtargets序列，6xNRE序列，luc2序列均由上海生化公司利用常规化学方法合成，按顺序合成得到PUF-miR。3)插入片段与载体重组：将上述扩增得到的片段与载体psiCHECK-2-HM471G混合制备成10ul的DNA溶液，加入等体积的连接酶，充分混匀反应。4)转化：取10ul的重组反应液与0.1ml的大肠杆菌感受态细胞混合，冰上30分钟，42℃热激90秒后迅速冰上5分钟。加入800ulLB液体培养基，37℃摇床孵育1小时。取上述菌液涂在含氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，正面向上半小时放置，待本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种监测miRNA动态变化的报告基因，其特征在于，所述的报告基因包括PUF基因、质粒psiCHECK‑2‑HM471G、Fluc基因、与目的miRNA完全互补配对的四段串联重复序列和与PUF完全互补配对的六段NRE串联重复序列。

【技术特征摘要】
1.一种监测miRNA动态变化的报告基因，其特征在于，所述的报告基因包括PUF基因、质粒psiCHECK-2-HM471G、Fluc基因、与目的miRNA完全互补配对的四段串联重复序列和与PUF完全互补配对的六段NRE串联重复序列。2.根据权利要求1所述的一种监测miRNA动态变化的报告基因，其特征在于，所述的与目的miRNA完全互补配对的四段串联重复序列位于PUF蛋白的终止密码子TGA下游。3.根据权利要求1所述的一种监测miRNA动态变化的报告基因，其特征在于，所述的与PUF完全互补配对的六段NRE串联重复序列位于Fluc基因起始密码子ATG上游。4.根据权利要求1～3中任一项所述的一种监测miRNA动态变化的报告基因，其特征在于，所述的报告基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。5.权利要求1所述的监测miRNA动态变化的报告基因的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将PUF基因克隆到质粒psiCHECK-2-HM471G多克隆位点上，得到质粒psiCHECK-2-HM471G-PUF；2)将Fluc...

【专利技术属性】
技术研发人员：王福，施潇蕊，王希楠，郑海锋，陈思，解锦荣，毛文杰，郭镔，
申请(专利权)人：西安电子科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61