一种SLC25A13基因突变的检测方法及其引物组技术

本发明专利技术涉及分子生物学基因技术领域和医学领域，具体公开了一种用于检测SLC25A13基因突变的方法及其引物组。本发明专利技术对希特林蛋白缺乏症相关SLC25A13基因的5个热点突变位点的核酸序列进行分析，设计相应的引物，对样本基因组DNA特定位点经过多重PCR扩增，最后以Ion Torrent半导体芯片测序技术进行检测。本发明专利技术的检测方法具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，检测速度快等优点。为希特林蛋白缺乏症遗传学方面的检测、测试、分析和评估提供了一条快速、可靠、准确的新途径，从而为该类疾病的临床诊断提供理论基础。

A Method for Detecting SLC25A13 Mutation and Its Primer Group

【技术实现步骤摘要】
一种SLC25A13基因突变的检测方法及其引物组
本专利技术涉及分子生物学基因
和医学领域，涉及用分子生物学方法对SLC25A13基因突变位点检测的引物组，特别涉及用IonTorrent半导体芯片测序技术对SLC25A13基因突变位点进行定性、定量检测的相关引物组及其试剂盒。
技术介绍
希特林蛋白缺乏症（Citrin缺乏症）是一类包含成年发作Ⅱ型瓜氨酸血症和希特林蛋白缺乏所致新生儿肝内胆汁淤积症两大疾病的常染色体隐性遗传性疾病。本病致病基因SLC25A13位于染色体7q21.3，编码的蛋白质称希特林蛋白。目前研究表明，希特林蛋白的功能主要是作为线粒体中天冬氨酸/谷氨酸载体。SLC25A13基因异常可导致所编码的希特林蛋白缺乏和成年发作Ⅱ型瓜氨酸血症或希特林蛋白缺乏所致新生儿肝内胆汁淤积症的发生。希特林蛋白缺乏症最初在日本发现，但近年来在中国、韩国、越南、以色列、捷克、美国和英国等也相继发现，并呈种族差异，提示本病可能在全球范围内广泛存在。Citrin缺乏症是由SLC25A13基因突变引起的一种常染色体隐性遗传性疾病。Citrin作为一种线粒体内钙结合天冬氨酸/谷氨酸载体蛋白，在尿素合成以及NADH的转运中发挥重要作用。Citrin缺乏症包含成人发作Ⅱ型瓜氨酸血症（CTLN2）及Citrin缺乏所致新生儿肝内胆内淤积症（NICCD）两种不同临床表型。该病特点：（a）地域性：Citrin缺乏症的地域性十分明显。在长江以南地区，大约每48人中就有一个人携带突变基因，而在长江以北，大约每760人中才有一人携带变异基因。（b）遗传性：Citrin缺乏症属于遗传性基因疾病。生出的孩子患有Citrin缺乏症，很可能遗传给下一代。但是会导致Citrin缺乏症的变异基因属于隐性遗传，只有父母身上都携带有变异的基因，生出的孩子才有四分之一的几率会患上Citrin缺乏症。Citrin的结构和功能：Citrin分子量约为74kDa，含675个氨基酸，在肝脏、肾脏及心脏中均有表达，位于线粒体内膜。Citrin的N端有4个EF手型结构域，可结合钙离子，C端作为线粒体载体活性部位有6个跨膜结构。研究还发现，Citrin的类似物－Aralar，同为天冬氨酸/谷氨酸载体蛋白，虽氨基酸序列与Citrin有77.8%的同源性，但组织分布明显不同，Citrin主要在肝脏而Aralar主要在骨骼肌和脑中表达，提示Citrin缺乏症是一种局限于肝脏的疾病。Citrin作为肝内主要的天冬氨酸/谷氨酸载体蛋白，其功能有3方面，其一，将线粒体中天冬氨酸转运至胞浆中，参与尿素、蛋白和核酸的合成。其二，将天冬氨酸转运至胞浆，作为苹果酸/天冬氨酸穿梭的一个环节，将胞浆中糖酵解生成的NADH还原当量运至线粒体内，参与能量、氨基酸、糖和脂代谢。其三，在NADH形成及利用的同时促进乳糖糖异生。Citrin缺乏症的发病机制：Citrin缺乏时，一方面可使尿素循环受阻，导致瓜氨酸积聚及高氨血症。另一方面天冬氨酸减少将使草酰乙酸生成减少，造成NADH/NAD+升高，引发各种代谢紊乱，抑制了糖酵解、糖异生、UDP半乳糖差向异构酶，扰乱了蛋白质及核酸合成，同时抑制脂肪酸氧化，促进脂肪合成。Citrin缺乏症相关SLC25A13基因的5个热点突变位点分别为SLC25A13(p.S225X)、SLC25A13(851del4)、SLC25A13(1638ins23)、SLC25A13(IVS6+5G>A)、SLC25A13(IVS11+1G>A)，正常人群SLC25A13基因突变筛查结果显示各突变位点的人群覆盖比率为：851del4(70%)、1638ins23(3%)和IVS6+5G﹥A（23%）在中国人中常见；851del4(20%)、S225X(25%)、IVS11+1G﹥A（45%）在日本人中常见。目前检测Citrin缺乏症相关SLC25A13基因突变位点的方法有PCR-RFLP、RT-PCR、经典测序、溶解曲线分析等，存在通量低、成本贵等问题，对PCR产物长度也有一定限制。IonTorrent半导体芯片测序技术是新一代的测序技术，它的核心技术是使用半导体技术在化学和数字信息之间建立直接的联系。在半导体芯片的微孔中的微球上固定DNA链，随后依次掺入单核苷酸dGTP、dCTP、dATP、dTTP。随着每个碱基的掺入，释放出H+，H+在它们穿过每个孔底部时能被检测到，通过对H+的检测，实时判读碱基。由于其化学测序原理自然简单，无修饰的核苷酸、无激光器或光学检测设备，因而可达到极小的测序偏差和出色的测序覆盖均衡度，一台仪器即可适合各种测序通量需求的科学研究，在较短的时间内获得真实可靠的实验结果。IonTorrent半导体芯片测序技术与传统Sanger法及二代测序技术比较，IonTorrent技术有以下优势：系统无激光光源，无光学系统，无照相系统；使用无标记的核苷酸及酶进行测序，本底干扰低；通过对H+的检测，可以改善碱基判读准确性；测序通量大、速度快，完成1G通量的测序检测仅需2~3小时，是传统Sanger测序方法通量的数千倍以上，同时弥补了已有二代高通量测序方法工作时间过长的缺陷。目前尚没有报道IonTorrent半导体芯片测序技术专门用于SLC25A13基因突变的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了弥补现有技术的不足，提供针对SLC25A13基因突变的定性、定量检测的方法及其引物。为解决上述问题，本专利技术采取以下技术方案：利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的Citrin缺乏症相关SLC25A13基因的5个热点突变位点核酸序列信息，用PrimerExpressSoftware5.0软件设计PCR引物。用于检测SLC25A13(p.S225X)基因位点的引物，是由序列表中SEQIDNO:1和SEQIDNO:2组成的引物对。上游引物：5’-agtagaattacatcccatcaagttagtttctcct-3’SEQIDNo:1；下游引物：5’-cttagtcacttcaacatctttcctg-3’SEQIDNo:2。用于检测SLC25A13(851del4)基因位点的引物，是由序列表中SEQIDNO:3和SEQIDNO:4组成的引物对。上游引物：5’-agtagaattagcttgtgtttgtttttccccta-3’SEQIDNo:3；下游引物：5’-ggagcaatccgttcaatgtct-3’SEQIDNo:4。用于检测SLC25A13(1638ins23)基因位点的引物，是由序列表中SEQIDNO:5和SEQIDNO:6组成的引物对。上游引物：5’-agtagaattactttagtgacccctgctgatg-3’SEQIDNo:5；下游引物：5’-cagtatccttctaaagcagtctatcac-3’SEQIDNo:6。用于检测SLC25A13(IVS6+5G>A)基因位点的引物，是由序列表中SEQIDNO:7和SEQIDNO:8组成的引物对。上游引物：5’-agtagaattagcctccttttgtagaagaatgtc-3’SEQIDNo:7；下游引物：5’-agtaaaaccact本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测SLC25A13基因突变的方法及其引物组，具体步骤为：利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的希特林蛋白缺乏症相关SLC25A13基因的5个热点突变位点核酸序列信息，用Primer Express Software 5.0软件设计PCR引物；采用多重PCR的方法对待检测样本进行PCR扩增；将PCR扩增产物进行扩增子文库的构建，ISP（Ion Sphere™ Particles, Ion微球）模板的制备，在Ion Torrent PGM系统上进行测序，并用软件对相关测序序列进行分析。

【技术特征摘要】
1.一种检测SLC25A13基因突变的方法及其引物组，具体步骤为：利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的希特林蛋白缺乏症相关SLC25A13基因的5个热点突变位点核酸序列信息，用PrimerExpressSoftware5.0软件设计PCR引物；采用多重PCR的方法对待检测样本进行PCR扩增；将PCR扩增产物进行扩增子文库的构建，ISP（IonSphere™Particles,Ion微球）模板的制备，在IonTorrentPGM系统上进行测序，并用软件对相关测序序列进行分析。2.如权利要求1所述的一种检测SLC25A13基因突变的方法及其引物组，其特征在于，所述的PCR引物组包括针对SLC25A13基因5个突变位点的引物，其序列分别为：SEQIDNo:1-SEQIDNo:10：5’-agtagaattacatcccatcaagttagtttctcct-3’SEQIDNo:1；5’-cttagtcacttcaacatctttcctg-...

【专利技术属性】
技术研发人员：裘敏燕，
申请(专利权)人：上海联吉医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31