一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器及其检测方法和应用技术

本发明专利技术提供一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器及其检测方法和应用。本发明专利技术中将修复酶的特异性与末端脱氧核苷酸转移酶介导的聚合延伸相结合，以启动核酸内切酶IV诱导的循环切割信号探针，诱导Endo IV裂解信号探针中的AP位点，导致信号探针上AF488荧光团的释放，同时产生具有游离3'‑OH末端的信号探针。具有游离3'‑OH的每个信号探针可以通过TdT有效地延长以产生长的poly‑A序列。释放的poly‑A序列和新产生的poly‑A序列可以诱导信号探针的多次循环切割，释放出更多的AF488荧光团。在磁力分离下，上清液中的荧光团可以通过单分子成像定量。具有良好的实际应用之价值。

A fluorescent chemical sensor for detecting oxidative damage in telomeres and its detection method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器及其检测方法和应用
本专利技术属于生物检测和分子生物学
，具体涉及一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器及其检测方法和应用。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。端粒由双链的重复序列(TTAGGG)n组成且具有单链的突出末端。端粒封闭真核染色体的末端并在基因组的稳定性和细胞活力中发挥关键作用。TTAGGG重复序列的富含G的特性使端粒极易受氧化损伤，特别是在单链区域，因为它更容易与氧化剂反应。氧化性损伤8-oxoG和FapyG是脱氧鸟苷(dG)最常见的氧化产物，可以通过引起复制错误和转录干扰诱导遗传毒性。端粒中富含的G碱基有助于氧化应激过程中G氧化性损伤的优先积累，而且它的修复效率比基因组中其他序列中的G损伤偏低。端粒的氧化损伤与端粒长度和完整性的变化有关，这将导致多种疾病的发生，如心血管疾病，糖尿病和癌症。因此，检测端粒中的氧化损伤水平将为分子医学，早期诊断和化学品的遗传毒性提供巨大益处。目前，检测基因组中8-oxoG的最常用方法包括高效液相色谱(HPLC)与电化学检测相结合(HPLC-ECD)以及HPLC与气相色谱-质谱联用(HPLC-MS)/MS)。这些方法可以提供更准确的8-oxoG计数，但需要把DNA序列消化成单个核苷酸碱基，而且需要复杂的仪器设备及繁琐的实验步骤。迄今为止，由于低丰度和高度重复的基因区域，很少有方法可用于检测端粒中的氧化性损伤水平。最近，纳米孔技术和基于定量PCR(q-PCR)的方法可以用于检测人端粒序列中的氧化性损伤。然而，专利技术人发现，它们需要特定的损伤标记和复杂的热循环仪来精确控制热循环。利用腺苷的衍生物三磷酸Adap可用于区分人端粒序列中的8-oxoG损伤和正常的G碱基，但是该方法难以定量8-oxoG损伤。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术提供一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器及其检测方法和应用。本专利技术中将修复酶的特异性与末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的聚合延伸相结合，以启动核酸内切酶IV(EndoIV)诱导的循环切割信号探针，诱导EndoIV裂解信号探针中的AP位点，导致信号探针上AF488荧光团的释放，同时产生具有游离3'-OH末端的信号探针。具有游离3'-OH的每个信号探针可以通过TdT有效地延长以产生长的poly-A序列。释放的poly-A序列和新产生的poly-A序列可以诱导信号探针的多次循环切割，释放出更多的AF488荧光团。在磁力分离下，上清液中的荧光团可以通过单分子成像定量。本专利技术无需复杂的仪器或繁琐的程序，同时检测灵敏度高，具有良好的实际应用之价值。本专利技术是通过如下技术方案实现的：本专利技术的第一个方面，提供一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器，所述荧光化学传感器至少包括信号探针、捕获探针和辅助探针。其中，所述信号探针为具有脱嘌呤嘧啶位点(AP位点)的富T单链DNA序列，所述信号探针5'端修饰有生物素，所述信号探针3'端修饰有荧光基团，优选使用AF488进行修饰；进一步的，所述信号探针与链霉抗生物素蛋白包被的磁珠进行缀合。所述捕获探针用于捕获富集端粒，其具有与端粒杂交的单链DNA序列，所述捕获探针3'端进行生物素化修饰；所述辅助探针为3'端用ddC修饰的单链DNA序列，其与单链端粒杂交形成甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶的dsDNA底物。进一步的，所述荧光化学传感器还包括甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶、末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、核酸内切酶IV和T4-多核苷酸激酶。进一步的，所述端粒内氧化性损伤包括8-oxoG损伤。本专利技术的第二个方面，提供基于上述荧光化学传感器检测端粒内氧化性损伤的方法，所述方法包括：S1、用dsDNA片段酶消化提取基因组DNA，获得具有50-200bp的DNA；S2、加入捕获探针和链霉抗生物素蛋白包被的磁珠孵育处理，捕获探针用于捕获富集端粒；S3、加入TdT进行孵育处理，催化三磷酸脱氧核苷酸(dATPs)重复加入DNA分子的3'-羟基末端(3'-OH)；S4、加入辅助探针、甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶进行孵育处理，其中辅助探针用于与单链端粒杂交以形成甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶的dsDNA底物；S5、加入TdT、核酸内切酶IV和磁珠偶联信号探针进行孵育处理；S6、磁分离后，对上清液进行单分子检测。本专利技术的第三个方面，提供上述荧光化学传感器和/或检测方法在检测端粒内氧化性损伤中的应用。所述端粒内氧化性损伤包括8-oxoG损伤。本专利技术首次提出了能够检测和量化人类端粒氧化损伤的超灵敏单分子成像技术。单分子检测是生物分子分析的有力工具，具有灵敏度高，样品消耗低，信噪比高的优点，并已成为DNA糖基化酶，DNA表观遗传修饰，蛋白质修饰和生物过程动态研究的有前途的方法。在本专利技术中，将修复酶的特异性与末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的聚合延伸相结合，以启动核酸内切酶IV(EndoIV)诱导的循环切割信号探针，导致AF488荧光团的释放。值得注意的是，TdT是一种无模板的聚合酶，它可以催化三磷酸脱氧核苷酸(dATPs)重复加入DNA分子的3'-羟基末端(3'-OH)。因此，每个端粒片段在氧化受损碱基的位置产生3'-OH，并且通过TdT有效地延长产生长的poly-A序列。信号探针与生成的polyA序列结合之后，诱导EndoIV裂解信号探针中的AP位点，释放出AF488荧光团，poly-A序列，同时产生具有游离3'-OH末端的信号探针。具有游离3'-OH的每个信号探针可以通过TdT有效地延长以产生长的poly-A序列。释放的poly-A序列和新产生的poly-A序列可以诱导信号探针的多次循环切割，释放出更多的AF488荧光团。在磁力分离下，上清液中的荧光团可以通过单分子成像定量。该方法可以在混合体系中检测到0.001％的氧化性损伤。此外，该方法可以灵敏地检测不同浓度的H2O2诱导的氧化应激中端粒内氧化性损伤的变化，甚至可以检测到从1000μMH2O2处理的HeLa细胞中提取的0.1ng基因组DNA中端粒内的氧化性损伤。而且通过标准的线性关系方程可以计算出每个HeLa细胞中端粒中含有34-44个氧化性损伤位点。本专利技术有益效果：(1)本专利技术整个反应在等温条件下进行：传统的检测8-oxoG的方法往往需要复杂的仪器或繁琐的程序，与之相比，本专利技术整个反应在等温条件下进行不需要复杂的仪器或繁琐的程序。(2)本专利技术利用TDT和EndoIV的结合不仅消除了模板或特异性限制酶识别序列对切口酶切裂的参与还大大提高了检测灵敏度。TDT介导的模板非依赖性聚合延伸和EndoIV介导的信号探针切割消除了模板或特异性限制酶识别序列对切口酶切裂的参与，并且TDT和EndoIV的结合可诱导信号探针的环状切割和延伸，触发后续的信号放大级联反应，大大提高了检测灵敏度。(3)本专利技术引入磁分离和单分子法的高信噪比提供了接近零的背景信号，进一步提高了检测灵敏度。单分子检测是生物分子分析的有力工具，具有灵敏度高，样品消耗低，信噪比高的优点。本专利技术引入单分子法的高信本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器，其特征在于，所述荧光化学传感器至少包括信号探针、捕获探针和辅助探针；所述信号探针为具有脱嘌呤嘧啶位点的富T单链DNA序列，所述信号探针5'端修饰有生物素，所述信号探针3'端修饰有荧光基团，优选使用AF488进行修饰；优选的，所述信号探针与链霉抗生物素蛋白包被的磁珠进行缀合；所述捕获探针用于捕获富集端粒，其具有与端粒杂交的单链DNA序列，所述捕获探针3'端进行生物素化修饰；所述辅助探针为3'端用ddC修饰的单链DNA序列，其与单链端粒杂交形成甲酰胺嘧啶[fapy]‑DNA糖基化酶的dsDNA底物。

【技术特征摘要】
1.一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器，其特征在于，所述荧光化学传感器至少包括信号探针、捕获探针和辅助探针；所述信号探针为具有脱嘌呤嘧啶位点的富T单链DNA序列，所述信号探针5'端修饰有生物素，所述信号探针3'端修饰有荧光基团，优选使用AF488进行修饰；优选的，所述信号探针与链霉抗生物素蛋白包被的磁珠进行缀合；所述捕获探针用于捕获富集端粒，其具有与端粒杂交的单链DNA序列，所述捕获探针3'端进行生物素化修饰；所述辅助探针为3'端用ddC修饰的单链DNA序列，其与单链端粒杂交形成甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶的dsDNA底物。2.如权利要求1所述的检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器，其特征在于，所述信号探针的碱基序列如下：5'-Biotin-TTTTTTTTTXTTTTTTTT-AF488-3'；其中X代表脱嘌呤嘧啶位点；所述捕获探针的碱基序列如下：CCTAACCCTAACCCTAACCCTTTT-Biotin；所述辅助探针的碱基序列如下：5'-CCTAACCCTAACCCTAAddC-3'；优选的，所述荧光化学传感器还包括甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶、末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、核酸内切酶IV和T4-多核苷酸激酶。3.如权利要求1或2任一项所述的检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器，其特征在于，所述端粒内氧化性损伤包括8-oxoG损伤。4.基于权利要求1-3任一项所述荧光化学传感器检测端粒内氧化性损伤的方法，其特征在于，所述方法包括：...

【专利技术属性】
技术研发人员：张春阳，张艳，华若男，相东雪，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37