一种基质循环连续发酵生产细菌纤维素的方法技术

本发明专利技术公开了一种基质循环连续发酵生产细菌纤维素的方法，属于发酵工程技术领域。本发明专利技术提供了一种连续发酵生产细菌纤维素膜的方法，在K.rhaeticus发酵生产细菌纤维素过程中，通过移离BC膜—置换菌体及培养基—补料的操作模式，提高细菌纤维素的生产效率，同时培养基成本也能得到进一步降低，在细菌纤维素生产工业中具有较好的应用前景。

A Method of Bacterial Cellulose Production by Substrate Cyclic Continuous Fermentation

【技术实现步骤摘要】
一种基质循环连续发酵生产细菌纤维素的方法
本专利技术涉及一种基质循环连续发酵生产细菌纤维素的方法，属于发酵工程

技术介绍
细菌纤维素(BacterialCellulose，BC)是一类由微生物产生的纯纤维素，是葡萄糖单体分子以由α-1,4-糖苷键聚合而成的高分子聚合物。与植物纤维相比，BC不含木质素和半纤维素，具有优良的生物相容性和生物可降解性，以及精细的网状结构、高结晶度、高抗张强度等独特性质，被公认为世界上安全的性能优异的新型生物材料。自然界中仅有少数几种菌产BC，主要集中于醋酐菌属和假胞杆菌属等微生物，其中醋杆菌中的木醋杆菌(Acetobacterxylinus)发现最早、研究较为彻底的BC产生菌，该菌株的培养周期相对较长，限制了其在工业化生产中的应用。从传统发酵食品中分离到的Komagataeibacterrhaeticus菌株具有很强的BC合成能力，与木醋杆菌产生的BC膜具有相似的理化、形态和力学性能，且未经处理的原膜的纤维素密度更高，可广泛应用于相同的领域，可作为BC生物合成的替代菌。BC在食品、医用材料等领域有广泛的应用前景，但是产量一直是限制其进一步应用的重要因素。一方面，由于Komagataeibacterrhaeticus是一个好氧菌，合成BC时对氧的需求量很大，发酵过程中纤维素膜总是在培养液的气液界面形成，菌体则富集在BC膜内。随着发酵时间的延长，膜厚度的增加，导致营养物质的传递受到影响，BC的合成速率下降，不利于产量的继续提高。另一方面，发酵过程中生成的BC膜占据了发酵空间，且膜具有极强的持水性，吸附了大量的含有营养物质的培养液，不利于菌体充分利用营养物质，从而降低底物的转化，增加生产成本。
技术实现思路
为了提高BC的实际利用价值，应用高产菌株进行高强度发酵提高BC的产量，为BC的应用扫除障碍，本专利技术提供了一种连续发酵生产细菌纤维素膜的方法，在提高细菌纤维素膜的生产效率，控制细菌纤维素膜的生产稳定性。本专利技术的第一个目的是提供一种减少种子液的制备时间，提高菌体的重复利用效率，连续发酵生产细菌纤维素膜的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将产细菌纤维素的菌株种子液接种至培养体系中培养至产生细菌纤维素膜；(2)定期将培养体系表面的细菌纤维素膜移离气液界面或将膜下沉到液面以下；(3)将步骤(2)移出的BC膜在一定量的培养液中振荡培养一定时间，以使菌体从膜中迁移至培养液中，然后将培养液回用到初始培养体系中以补充基质和回用菌体。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(3)具体为：将步骤(2)移出的纤维素膜在低浓度的培养液中振荡处理一定时间，使纤维素膜携带的营养物质置换至培养液中、纤维素膜上的菌体迁移至溶液中，以利于菌体和营养物质的进一步利用，同时降低膜中蛋白质含量；所述低浓度的培养液是指培养液中的营养成分浓度低于初始培养基中的营养成分浓度。在本专利技术的一种实施方式中，所述低浓度的培养液是将发酵培养基稀释2～3倍后的溶液。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法重复步骤(2)和(3)。在本专利技术的一种实施方式中，所述产细菌纤维素的菌株为KomagataeibacterrhaeticusWM407-1，已于2016年4月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016213，该菌株已在公开号为CN105802896A的专利申请中公开。在本专利技术的一种实施方式中，所述种子液是将菌株接种至种子培养基中，在150～200r/min，28～30℃培养1～2天。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)的培养条件是在150-200r/min、30℃条件下间歇振荡或搅拌培养。在本专利技术的一种实施方式中，每2～4天将培养体系表面的纤维素膜移出。在本专利技术的一种实施方式中，所述移离气液界面是采用无菌涂布棒将生长在气液界面上的BC膜揿压入液面下方，再继续培养0.5-2小时后将培养体系中的纤维素膜取出。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(3)将纤维素膜携带的营养物质在低浓度培养液中交换0.5-2h。在本专利技术的一种实施方式中，交换后的培养液全部回用至培养体系中。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法在含有筛网的容器中进行，并采用筛网转移纤维素膜。在本专利技术的一种实施方式中，所述培养体系中还补加乙醇。在本专利技术的一种实施方式中，所述乙醇补料至培养体系中的浓度为10～30g/L。本专利技术的第二个目的是提供应用上述方法制备的细菌纤维素膜。本专利技术还要求保护所述方法制备的细菌纤维素膜在生物、医药、化工领域的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用包括但不限于作为面膜基材或创面敷料。有益效果：(1)本专利技术通过发酵过程中进行取膜—培养基的营养基质及菌体置换—补加乙醇等操作，并控制发酵工艺条件，实现了BC膜的连续、高效生产。本专利技术解决了由于膜的积累导致的发酵体系空间变小从而不利于产量的继续提高的问题，相对于非补料模式，BC膜的生产周期缩短，生产效率显著提高。(2)本专利技术通过在BC膜发酵过程中，定期将生成的BC膜移离或浸没到液面下方，用低浓度培养液对膜片中的基质进行交换，更有利于培养基成分和菌体的回用及纤维素膜的稳定生产，采用培养基营养成分和菌体回用技术比未采用回用技术时，BC膜产量的提高量至少提高29.57％，并大大降低了培养基的成本。(3)本专利技术通过移离或揿压的方式，可实现BC膜在保持形状、大小、密度稳定的前提下的连续生产，且操作简单，有助于大规模生产条件下的工艺控制。具体实施方式所用固体斜面培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，Na2HPO48g/L，MgSO40.5g/L，琼脂20g/L，pH6.3，115℃灭菌20min，冷却待用。所用液体种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，Na2HPO48g/L，MgSO40.5g/L，乙醇20g/L，调节pH至6.3，过滤除菌后待用。所用发酵培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，乙醇20g/L，调节pH至6.3，过滤除菌后待用。所用纤维素膜干重的测定方法：培养液中取出菌膜，用蒸馏水冲洗后，用l％的NaOH溶液80℃水浴中浸泡30min，再用蒸馏水反复冲洗，直到凝胶膜透明无色，于80℃烘箱中烘至恒重，称重。实施例1：将保藏在甘油管中的菌株KomagataeibacterrhaeticusWM407-1(CCTCCNO:M2016213)菌种涂布在固体平板上活化1天后，挑取接入种子培养基中，在150-200r/min、30℃条件下培养2天，每4h振荡或搅拌5min。然后将上述种子液按体积分数6％的接种量接入三角瓶或发酵罐体系下的发酵培养基，在30℃下间歇振荡或搅拌培养1天(每4h振荡或搅拌5min，振荡转速为150-200r/min或搅拌转速为50-100r/min)。将培养1天的发酵液全部移入消毒后带有可移动筛网的不锈钢圆桶中(体积为1L，装液量600mL)，在30℃条件下继续静置培养，培养2天后，气液界面形成一层纤维素膜，采用无菌涂布棒将生长在气液界面上的BC膜揿压入液面下方，补加一定量乙醇使发酵体系中乙醇终浓度为20g/L，BC膜浸在液体中，膜上的菌体能够从膜表面迁移至培养体系中，再继续培养2天，至生成了新的纤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种连续发酵生产细菌纤维素膜的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将产细菌纤维素的菌株种子液接种至培养体系中，培养至产生细菌纤维素膜；(2)定期将培养体系表面的细菌纤维素膜移离气液界面或下沉到液面以下；(3)使步骤(2)移离气液界面或下沉到液面以下的BC膜中的菌体迁移至培养体系中，并继续培养。

【技术特征摘要】
1.一种连续发酵生产细菌纤维素膜的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将产细菌纤维素的菌株种子液接种至培养体系中，培养至产生细菌纤维素膜；(2)定期将培养体系表面的细菌纤维素膜移离气液界面或下沉到液面以下；(3)使步骤(2)移离气液界面或下沉到液面以下的BC膜中的菌体迁移至培养体系中，并继续培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体为：将步骤(2)移出的纤维素膜在低浓度的培养液中振荡处理一定时间；所述低浓度的培养液是指培养液中的营养成分浓度低于初始培养基中的营养成分浓度。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法重复步骤(2)和(3)。4.根据权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淼，康文术，曾伟主，颜少慰，李萧，
申请(专利权)人：江南大学，湖南御家化妆品制造有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32