一种维持小球藻细胞死亡后持续产氢的方法技术

一种维持小球藻细胞死亡后持续产氢的方法。本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种维持小球藻细胞死亡后持续产氢的方法。本发明专利技术的目的是将供电体系引入小球藻的生存环境中，通过利用其体内的氢化酶，使其在厌氧环境中实现高效、持续的产氢。方法：本发明专利技术以蛋白核小球藻为基本生物体，利用其体内的生物酶‑氢酶，通过外加导电介质吡咯和供电子体系，构筑一个完整的人工产氢体系。这种方法使生物酶得到高效充分的利用，不仅可以维持小球藻细胞生命体活性且在生命体“死”后仍能继续利用其体内的“活”性物质，使蛋白核小球藻在厌氧环境中持续高效产氢两个月以上。

A method for sustaining hydrogen production after Chlorella cell death

【技术实现步骤摘要】
一种维持小球藻细胞死亡后持续产氢的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种维持小球藻细胞死亡后持续产氢的方法。
技术介绍
随着全球经济的日益发展，人们对于能源的需求也日益增大，随之带来的环境问题也日益紧迫，化石能源日益枯竭，寻找一种煤、石油等化石燃料的替代品显得尤为重要，生物燃料作为一种可再生能源且能大规模生产引发了越来越多科技工作者的关注和思考。氢能作为一种清洁、高效的能源，其燃烧产物只有水不会对环境造成任何污染，且其热值高、能量转化率高，受到人们的广泛青睐。但是目前制氢的方法还存在许多问题，电解水制氢是一种应用比较广泛且成熟的方法，但由于其消耗电能大，成本高，应用受到限制；矿物燃料制氢包括煤焦化、气化制氢，天然气或轻质油制氢，重油氧化制氢等，其不仅生产过程中产生的副产物对环境造成污染且不可持续、成本高不利于长期的应用和发展。相比之下，生物制氢具有节约能源、清洁、原料来源广泛、生产过程温和等优点，所谓生物制氢其实质就是利用生物产生氢气的方法。生物制氢包含三种方法，光合生物产氢、发酵细菌产氢、光合生物与发酵细菌。[BenemannJR,BerensonJA,KamenKMD.HydrogenEvolutionbyaChloroplast-Ferredoxin-HydrogenaseSystem[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1973,70(8):2317-2320.]现只介绍光合生物产氢，在生物的光合系统中有两个相对独立但又相互协调的光合作用中心，分别是光合系统II(PSII)用于接收太阳能分解水产生H+光合电子和O2和光合系统I(PSI)用于产生还原剂来固定CO2。PSII产生的光合电子由铁氧化还原蛋白携带经由PSII和PSI到达氢酶催化质子氢产生氢气。因此在整个过程中，氢酶是产氢的关键因素。但是由于氢酶对氧气极为敏感，而PSII光解水伴随着大量氧气的放出，短时间内就能完全抑制氢酶反应的进行。因此只有在厌氧的环境下氢酶才能够被激活发挥作用。目前，利用氢酶的方式分别有从细胞中提取氢酶通过外界模拟细胞内电子传递机制来实现产氢[BrownKA,WilkerMB,BoehmM,etal.CharacterizationofPhotochemicalProcessesforH2ProductionbyCdSNanorod–[FeFe]HydrogenaseComplexes[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2012,134(12):5627-5636.]，通过基因工程制备耐氧氢酶模拟物产氢[SakaiT,MerschD,ReisnerE.PhotocatalyticHydrogenEvolutionwithaHydrogenaseinaMediator-FreeSystemunderHighLevelsofOxygen**[J].AngewandteChemie,2013,52(47):12313-12316.]，仿生硅化诱导自组装产氢[WeiXiong,XiaohongZhao,GenxingZhu,ChangyuShao,YalingLi,WeiminMa,XurongXu,andRuikangTang,Angew.Chem.,2015,127,12129.]等方法，但是天然酶的提取过程麻烦且储存困难，成本高，氢酶模拟物的制备复杂且活性低，仿生硅化的方法也只能实现短时间内的产氢。
技术实现思路
本专利技术的目的是将供电体系引入小球藻的生存环境中，通过利用其体内的氢化酶，使其在厌氧环境中实现高效、持续的产氢，而提供了一种维持小球藻细胞死亡后持续产氢的方法。一种维持小球藻细胞死亡后持续产氢的方法具体是按以下步骤进行的：一、蛋白核小球藻细胞的培养：选择蛋白核小球藻作为生物模板，利用BG-11培养基在温度为25～30℃的光照培养箱中持续光照1200～4800LUX进行培养，当蛋白核小球藻细胞数目达到对数生长期时进行包覆，得到生长对数期的蛋白核小球藻细胞；二、采用去离子水对生长对数期的蛋白核小球藻细胞进行清洗，离心收集细胞，将收集到的细胞加入到九水合硝酸铁水溶液中，得到细胞溶液；将细胞溶液在转速为240～260r/min的条件下搅拌20～40min，反应完成后，采用去离子水清洗，离心收集，得到表面吸附Fe3+的小球藻细胞；所述九水合硝酸铁水溶液的浓度为1～1.5mg/mL；所述细胞溶液的OD值为0.5～1.5；三、将漆酶溶解在醋酸-醋酸钠溶液中，得到漆酶溶液，调节pH为4～7，将漆酶溶液与吡咯溶液同时加入到表面吸附Fe3+的小球藻细胞中，在转速为280～320r/min的条件下搅拌4～6h，反应完成后，采用去离子水清洗，离心收集，得到聚吡咯-漆酶修饰的蛋白核小球藻细胞；所述漆酶溶液的浓度为1～3mg/mL；所述漆酶溶液与表面吸附Fe3+的小球藻细胞的体积比为1:(5～9)；所述吡咯溶液与表面吸附Fe3+的小球藻细胞的体积比为1:(250～450)；四、将聚吡咯-漆酶修饰的蛋白核小球藻细胞加入到溶有邻苯二酚的TAP培养基溶液中，得到细胞培养液；同时配置浓度为140～160mmol/L的TEOA溶液，向其中加入水溶性伊红后采用浓度为5mol/L的盐酸将pH调至6～6.7，得到混合溶液；将细胞培养液和混合溶液混合密闭培养，利用氢气检测器监测修饰细胞不同时间段下的氢气量，即完成小球藻细胞死亡后持续产氢；所述聚吡咯-漆酶修饰的蛋白核小球藻细胞与溶有邻苯二酚的TAP培养基溶液的体积比为1:(5～10)；所述溶有邻苯二酚的TAP培养基溶液中邻苯二酚的含量为40～60mg/mL；所述浓度为140～160mmol/L的TEOA溶液与溶有邻苯二酚的TAP培养基溶液的体积比为1:(3～4)；所述水溶性伊红的质量与浓度为140～160mmol/L的TEOA溶液的体积比为1mg:(1.5～3)mL。本专利技术的有益效果：本专利技术制备了完整的产氢体系，解决了从生物体内提取酶成本高、储存困难易失活等问题。本专利技术方法产氢时间长，在生物体死亡的状态下仍能维持产氢，产氢时间目前测试为两个半月左右甚至更长，且产氢效率较高。本专利技术制备方法简单、可控性强、且耗氧物质为化工中间体邻苯二酚，减少对环境的污染，整个制备过程环保清洁。附图说明图1为实施例一步骤一所述蛋白核小球藻的扫描电子显微镜照片；图2为实施例一步骤三所述聚吡咯-漆酶修饰的蛋白核小球藻细胞的扫描电子显微镜照片；图3为实施例一步骤一所述蛋白核小球藻的透射电子显微镜照片；图4为实施例一步骤三所述聚吡咯-漆酶修饰的蛋白核小球藻细胞的透射电子显微镜照片；图5为聚吡咯-漆酶修饰的蛋白核小球藻细胞制备完成后采用FDA染色的激光共聚焦照片；图6为聚吡咯-漆酶修饰的蛋白核小球藻细胞包覆15天后采用PI染色的激光共聚焦图片；图7为实施例一与对比例一产氢量的对比柱状图，其中1为实施例一，2为对比例一；图8为加入敌草枯后实施例一、对比例一与对比例二产氢量的对比图，其中1为实施例一，2为对比例一，3为对比例二。具体实施方式具体实施方式一：本实施方式一种维持小球藻细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种维持小球藻细胞死亡后持续产氢的方法，其特征在于维持小球藻细胞死亡后持续产氢的方法具体是按以下步骤进行的：一、蛋白核小球藻细胞的培养：选择蛋白核小球藻作为生物模板，利用BG‑11培养基在温度为25～30℃的光照培养箱中持续光照1200～4800LUX进行培养，当蛋白核小球藻细胞数目达到对数生长期时进行包覆，得到生长对数期的蛋白核小球藻细胞；二、采用去离子水对生长对数期的蛋白核小球藻细胞进行清洗，离心收集细胞，将收集到的细胞加入到九水合硝酸铁水溶液中，得到细胞溶液；将细胞溶液在转速为240～260r/min的条件下搅拌20～40min，反应完成后，采用去离子水清洗，离心收集，得到表面吸附Fe

【技术特征摘要】
1.一种维持小球藻细胞死亡后持续产氢的方法，其特征在于维持小球藻细胞死亡后持续产氢的方法具体是按以下步骤进行的：一、蛋白核小球藻细胞的培养：选择蛋白核小球藻作为生物模板，利用BG-11培养基在温度为25～30℃的光照培养箱中持续光照1200～4800LUX进行培养，当蛋白核小球藻细胞数目达到对数生长期时进行包覆，得到生长对数期的蛋白核小球藻细胞；二、采用去离子水对生长对数期的蛋白核小球藻细胞进行清洗，离心收集细胞，将收集到的细胞加入到九水合硝酸铁水溶液中，得到细胞溶液；将细胞溶液在转速为240～260r/min的条件下搅拌20～40min，反应完成后，采用去离子水清洗，离心收集，得到表面吸附Fe3+的小球藻细胞；所述九水合硝酸铁水溶液的浓度为1～1.5mg/mL；所述细胞溶液的OD值为0.5～1.5；三、将漆酶溶解在醋酸-醋酸钠溶液中，得到漆酶溶液，调节pH为4～7，将漆酶溶液与吡咯溶液同时加入到表面吸附Fe3+的小球藻细胞中，在转速为280～320r/min的条件下搅拌4～6h，反应完成后，采用去离子水清洗，离心收集，得到聚吡咯-漆酶修饰的蛋白核小球藻细胞；所述漆酶溶液的浓度为1～3mg/mL；所述漆酶溶液与表面吸附Fe3+的小球藻细胞的体积比为1:(5～9)；所述吡咯溶液与表面吸附Fe3+的小球藻细胞的体积比为1:(250～450)；四、将聚吡咯-漆酶修饰的蛋白核小球藻细胞加入到溶有邻苯二酚的TAP培养基溶液中，得到细胞培养液；同时配置浓度为140～160mmol/L的TEOA溶液，向其中加入水溶性伊红后采用浓度为5mol/L的盐酸将pH调至6～6.7，得到混合溶液；将细胞培养液和混合溶液混合密闭培养，利用氢气检测器监测修饰细胞不同时间段下的氢气量，即完成小球藻细胞死亡后持续产氢；所述聚吡咯-漆酶修饰的蛋白核小球藻细胞与溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄鑫，祁家瑞，刘小曼，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23