一种砷响应荧光素酶报告载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种砷响应荧光素酶报告载体及其构建方法和应用。本发明专利技术的砷响应荧光素酶报告载体，其核苷酸序列为SEQ ID NO.10所示。本发明专利技术发现sECBS‑CS12m可以像ECBS‑CS一样与ArsR较强结合，但是对砷的响应比ECBS‑CS好很多，用sECBS‑CS12m来取代pECBS‑AFBS报告载体中的ECBS‑AFBS序列，构建得到报告载体psECBS‑CS12m，发现psECBS‑CS12m对砷介导的荧光素酶基因转录诱导显著优于pECBS‑AFBS和pECBS‑CS。本发明专利技术还提供了创新策略以构建更好的报告载体，这有利于研发更敏感的、通过诱导报告基因表达来监控环境砷的生物传感器。

An arsenic-responsive luciferase reporter vector and its construction method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种砷响应荧光素酶报告载体及其构建方法和应用
：本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种砷响应荧光素酶报告载体及其构建方法和应用。
技术介绍
：转录因子(TF)与其靶DNA结合序列之间的相互作用在基因转录调控中至关重要。每个真核TF都可以与染色体DNA上的一组相似DNA序列而非单个DNA序列结合。碱基组成决定了DNA序列对TF的结合亲和性，这可以通过靶序列的比对分析而获知。统计学上简单的位置权重矩阵(PWM)模型通常被用来计算保守的碱基结合序列。在保守序列内，某些碱基对与TF的相互作用是保守的，而其他碱基对则可以更加灵活并且在DNA与TF的相互作用中没有那么重要。与TF相互作用的各个碱基对的贡献由其保守性来评估。此外，保守结合序列还可以通过一些体外方法诸如ChIP-seq或SELEX等由TF特异结合的一组DNA片段或寡核苷酸来确定。然而，目前仍有超过40％的TF未知其靶结合序列。在原核细胞大肠杆菌中，大多数TF都与染色体DNA的单一位点结合，比如砷转录抑制因子(ArsR)。ArsR是一个与其操作子/启动子(O/P)序列结合的金属调控转录抑制因子。然而，由于在微生物染色体中存在大量的ArsR结合序列，通过PWM模型对这些结合序列进行比对分析也可以鉴定出其保守的结合序列或结合域。尽管PWM法可以广泛地用于鉴定TF的DNA结合序列，但是最近也有研究表明这种基于各个保守碱基对在蛋白质相互作用的独立贡献的模型已经不足以解释各种复杂的基因转录调控，比如对蛋白-DNA调控至关重要的相关二核苷酸或三核苷酸、来自保守序列低亲和结合位点的显著差异、与TF形成多蛋白复合物的新DNA结合特异性以及保守序列上下游对结合亲和性的影响等。这些因素以及真核细胞中TF辅因子的相互作用都使得TF-DNA识别变得复杂化。在本研究中，我们采用了更加简单的原核ArsR调控系统来评估TF与靶DNA序列之间的识别作用。ArsR属于Smt/ArsR家族蛋白，是一种通过与砷响应操纵子相互作用来控制砷抗性相关基因表达的调控蛋白。ArsR结合防止RNA聚合酶在无砷化合物的情况下与靶基因的O/P序列相互作用。ArsR一旦发生砷结合以后，ArsR蛋白即与启动子分离，随后激活砷抗性相关基因的表达。在质粒R773和大肠杆菌(E.coli)染色体中的ArsR蛋白已有较多研究。这两种ArsR蛋白质都是二聚体，在其靶DNA结合域起点处均含有Cys32-Val-Cys-Asp-Leu-Cys的砷结合序列。来自嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)的ArsR在该起点并没有砷结合序列，相反，它们的半胱氨酸残基位于第95、96和102位氨基酸残基处。Smt/ArsR家族蛋白以及A.ferrooxidans的ArsR蛋白的结合特性和保守序列均已阐明得非常清楚。在先前的研究中，我们构建了两种砷报告载体pLHPars9和pLLPars9(砷报告载体pLHPars9和pLLPars9公开于专利号201780001826.1，专利技术名称：一类亚砷酸盐抑制因子报告基因质粒及其构建方法和应用中)，其分别是高拷贝数和低拷贝数的质粒。我们在质粒R773的ArsR操纵子下游添加了常见的ArsR-荧光素酶融合元件，在操纵子上游添加了两个拷贝分别来自E.coli染色体的ArsR靶DNA结合序列(ECBS)和A.ferrooxidans染色体的ArsR靶DNA结合序列(AFBS)。这两个报告载体都对亚砷酸盐高度敏感，最低检出限为0.04μM亚砷酸盐(～5μg/L)，两种报告载体对金属的特异性不同，pLLPars9对亚砷酸盐较为特异，而pLHPars9则对亚砷酸盐和锑酸盐较为特异。pLLPars9与pLHPars9的唯一区别在于它们质粒的拷贝数不同。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于克服现有技术中砷检测中的不足，提供一种砷响应荧光素酶报告载体及其构建方法和应用。在本研究中，我们构建了一系列报告载体，分别包含两个拷贝不同来源的ArsR靶DNA结合序列。我们发现，pLLPars9质粒(在本专利技术中重命名为pECBS-AFBS)内的结合序列ECBS-AFBS(其核苷酸序列为CACATTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-ATCCACGAATATTTCTTGCA，如SEQIDNO.1所示)中的AFBS部分(其核苷酸序列为ATCCACGAATATTTCTTGCA，如SEQIDNO.2所示)可被聚球藻smt2/1的结合序列(即smt2/1BS，其核苷酸序列为gctaAACACATGAACAGTTATTCAGATATTcaaa，如SEQIDNO.3所示)或arsRBC的结合序列(即arsRBCBS，其核苷酸序列为tgtgATTAATCATATGCGTTTTTGGTTATGtgtt，如SEQIDNO.4所示)所取代，在砷处理下没有丧失荧光素酶基因的显著转录诱导，而ECBS部分(其核苷酸序列为CACATTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT，如SEQIDNO.5所示)被smt2/1BS或arsRBCBS取代则会导致荧光素酶基因转录诱导的剧烈降低。此外，AFBS部分也可以被衍生自arsRBCBS保守序列的某些碱基替换取代。通过在第二结合序列的非保守性碱基对位置替换不同碱基从而形成一系列探针，我们测试了这些探针与ArsR蛋白的相互作用，结果发现这些探针与ArsR蛋白的相互作用存在显著差异。有些非保守碱基对会像保守碱基对一样需要与ArsR相互作用，而有些非保守碱基对也会影响ArsR蛋白结合后的功能。我们发现sECBS-CS12m可以像ECBS-CS一样与ArsR较强结合，但是sECBS-CS12m对砷的响应比ECBS-CS好很多。并证明了psECBS-CS12m对砷介导的荧光素酶基因转录诱导显著优于pECBS-AFBS和pECBS-CS。因此，本专利技术的第一个目的是提供一种砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m，所述的砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m，其核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。本专利技术的第二个目的是提供所述的砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m的构建方法，包括以下步骤：在体外合成如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的DNA序列，退火生成含有XbaI和HindIII粘端的双链片段，将报告载体pLLPars9用XbaI和HindIII双酶切，得到含有XbaI和HindIII粘端的线性载体，将含有XbaI和HindIII粘端的双链片段和线性载体连接，获得砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m。本专利技术的第三个目的是提供所述的砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m在砷盐检测中的应用。所述的砷盐优选为亚砷酸盐。进一步优选为亚砷酸钠。本专利技术的第四个目的是提供所述的砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m在制备砷盐检测全细胞传感器中的应用。本专利技术的第五个目的是提供一种砷盐检测全细胞传感器，所述的砷盐检测全细胞传感器为含有所述的砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m的基因工程菌。所述的基因工程菌优选为大肠杆菌DH5α。本专利技术发现sECBS-CS12m可以像ECBS-CS一样与A本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种砷响应荧光素酶报告载体psECBS‑CS12m，其特征在于，所述的砷响应荧光素酶报告载体psECBS‑CS12m，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

【技术特征摘要】
1.一种砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m，其特征在于，所述的砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m，其核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。2.权利要求1所述的砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：在体外合成如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的DNA序列，退火生成含有XbaI和HindIII粘端的双链片段，将报告载体pLLPars9用XbaI和HindIII双酶切，得到含有XbaI和HindIII粘端的线性载体，将含有XbaI和HindIII粘端的双链片段和线性载体连接，获得砷响应荧光素酶报告载体ps...

【专利技术属性】
技术研发人员：李先强，陈杏娟，许玫英，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：广东,44