本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种橡胶树RNA聚合酶III型启动子，更具体涉及一种橡胶树U6基因启动子proHbU6.3，并进一步公开其克隆方法与应用。本发明专利技术首次在巴西橡胶树中克隆获得橡胶树RNA聚合酶III型启动子‑‑橡胶树内源U6启动子proHbU6.3，该启动子为橡胶树内源RNA聚合酶III型启动子，该启动子具有高效转录活性，可驱动下游sgRNA的表达，并通过瞬时转化橡胶树原生质体验证了该启动子的活性及其应用于橡胶树CRISPR/Cas9基因编辑系统的可行性，并实现了CRISPR/Cas9介导的橡胶树基因组靶向编辑。
Cloning and application of proHbU6.3, a promoter of U6 gene in Hevea brasiliensis
【技术实现步骤摘要】
一种橡胶树U6基因启动子proHbU6.3及其克隆与应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种橡胶树RNA聚合酶III型启动子，更具体涉及一种橡胶树U6基因启动子proHbU6.3，并进一步公开其克隆方法与应用。
技术介绍
天然橡胶一直是我国重要的战略物资和储备资源，目前，我国橡胶树新品种的选育仍然是以传统的杂交育种为主。由于橡胶树生长缓慢，导致了常规育种存在效率低、周期长的问题，这严重地阻碍了橡胶树育种的进程。随着生物技术的发展，分子育种技术在橡胶树中的应用加快了橡胶树新品种的培育，通过农杆菌或基因枪导入外源基因成为橡胶树遗传改良的重要方式。然而，在上述外源基因片段导入的过程中，基因片段是随机地插入橡胶树基因组的，不仅插入位点不受控制，同时还存在位置效益等问题(Yutaka等，2018，Chromosoma，doi:10.1007/s00412-018-0677-6.)。CRISPR/Cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatednuclease9)基因组编辑技术的出现为基因组的精确修饰提供了新的途径(Yongwei等，2016，FrontPlantSci,7:1928；Collonnier等，2017，Methods,121-122:103-117；Yutaka等，2018，Chromosoma,doi:10.1007/s00412-018-0677-6)，其介导基因编辑的基本原理是依靠单链向导RNA(singleguideRNA,sgRNA)引导下，利用核酸酶Cas9定点结合和切割基因组特异性位点(PAM)上游特定靶位点，产生DNA双链断裂(DSBs)，进而引起靶位点的突变。同时，通过同源重组修复(HR)或非同源末端连接(NHEJ)生物内源修复机制，也可将外源供体DNA插入到sgRNA靶位点，从而实现对基因组上特定位点的突变以及特定DNA片段的敲除、插入及替换等(Lee等，2017,Elife,6:e25312.；Smirnikhina等，2018，HumGenet,138(1):1-19.)，并由此实现目标基因的精准化品种改良。目前，在拟南芥(MikiD等，2018,NatCommun.9(1):1967.)、水稻(LiJ等，2016,NatPlants,2(10):16139.)及玉米(Gil-HumanesJ等，2017,PlantJ,89(6):1251-1262.)等植物中已经利用基于质粒CRISRP/Cas9基因组编辑技术实现了外源基因的导入。此外，在玉米、小麦、水稻中也已经通过CRISPR/Cas9-sgRNARNP瞬时转化也实现了外源基因的导入(SvitashevS等，2015,PlantPhysiol,169(2):931-945.；LiangZ等，2017,NatCommun,8:14261.；SunYW等，2016,MolPlant,9(4):628-631)；另外，Liang等(2018，NatureProtocols,13(3):413-430.)也利用基因枪将Cas9和sgRNA表达载体质粒，通过瞬时转化受体细胞实现基因编辑。研究显示，在CRISPR/Cas9基因编辑体系中，受体细胞中sgRNA的含量水平是影响编辑效率的重要因素之一，因此，可精确启动sgRNA体内转录的聚合酶III型启动子得到了广泛的关注(Jinek等,2016，science337:816-821；Mali等，2013，science339:823-826；Cong等，2013，Science339:819-823)。U6RNA是一种参与mRNA前体剪接的非编码RNA，其对应的U6启动子是一类RNA聚合酶III型启动子，并已经在许多物种的CRISPR/Cas9系统中得到了大量的应用(Kim和Nam,，2013，plantmol.Bio.Rep.31:581-593；Li等，2007，J.integrateplantbiol..49:222-229；H.Jia等，2014,pone，9(4):e93806.)。虽然CRISPR/Cas9基因组编辑技术目前已在多个物种中得到广泛地应用，但是针对橡胶树的基因编辑技术尚且未见报道。这主要是由于虽然在许多物种中U6启动子已有大量的报道，但外源的的U6启动子通常并不适用(X.Sun等，2015，Sci.Rep.,5p.10342)。可见，缺少适用的U6启动子已成为目前橡胶树CRISPR/Cas9基因编辑体系的限制因子，也限制了CRISPR/Cas9基因组编辑技术在橡胶树育种中的应用。因此，筛选出在橡胶树中有功能活性的U6启动子对于橡胶树的基因育种技术发展具有积极的意义。
技术实现思路
为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种橡胶树U6基因启动子proHbU6.3，并进一步公开其克隆方法及应用。为解决上述技术问题，本专利技术所述的一种橡胶树U6基因启动子proHbU6.3，所述启动子proHbU6.3包括如SEQIDNo：1所示的DNA核苷酸序列。上述橡胶树U6基因启动子proHbU6.3属于橡胶树U6snRNA基因的RNA聚合酶III型启动子，来源于巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)。具体的，所述启动子proHbU6.3的DNA核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。本专利技术还公开了一种橡胶树瞬时转化编辑载体，即含有所述的橡胶树U6基因启动子proHbU6.3。具体的，所述瞬时转化编辑载体为重组质粒proHbU6.3-sgRNA-163Cas9M。本专利技术还公开了一种克隆所述的橡胶树U6基因启动子proHbU6.3的方法，包括如下步骤：(1)以巴西橡胶树热研7-33-97叶片基因组DNA为模板，设计如下特异引物：proHbU6.3-F：GAACCATATGCTTAGTTCATCTTTC；proHbU6.3-R：CAGCCTGATGCTTCTGTTCTATC；(2)使用KODFX酶在20μl反应体系中进行PCR扩增；(3)将扩增产物TA克隆到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌Dh5α中并挑重组载体单克隆测序，即得546bp橡胶树U6基因启动子DNA片段proHbU6.3。具体的，所述步骤(2)中，所述PCR扩增步骤的反应程序为：95℃预变性2min，98℃变性10s，59℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃终延伸5min。本专利技术还公开了一种构建所述的橡胶树瞬时转化编辑载体的方法，包括如下步骤：(a)将克隆的启动子proHbU6.3构建到中间载体SK-5G上用SalI和XhoI双酶切SK-5G载体，回收2913bp载体骨架片段，设计如下引物分别在proHbU6.3序列和载体gRNA序列两端引入同源序列，将proHbU6.3和gRNA组装到SK-5G载体上得到proHbU6.3-SK-5G：proHbU6.3-lF：GCGGCCGCAGATCTGCTAGCGTCGACGAACCATATGCTTAGTTCATC；proHbU6.3-lR：GTGTTGTGTTCACCTGCGAGCCAGCCTGATGCTTCTGTTC；gRNA-sF：本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种橡胶树U6基因启动子proHbU6.3，其特征在于，所述启动子proHbU6.3包括如SEQ ID No：1所示的DNA核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种橡胶树U6基因启动子proHbU6.3，其特征在于，所述启动子proHbU6.3包括如SEQIDNo：1所示的DNA核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的橡胶树U6基因启动子proHbU6.3，其特征在于，所述启动子proHbU6.3的DNA核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。3.一种橡胶树瞬时转化编辑载体，其特征在于，含有权利要求1或2所述的橡胶树U6基因启动子proHbU6.3。4.根据权利要求3所述的橡胶树瞬时转化编辑载体，其特征在于，所述瞬时转化编辑载体为重组质粒proHbU6.3-sgRNA-163Cas9M。5.一种克隆权利要求1或2所述的橡胶树U6基因启动子proHbU6.3的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以巴西橡胶树热研7-33-97叶片基因组DNA为模板，设计如下特异引物：proHbU6.3-F：GAACCATATGCTTAGTTCATCTTTC；proHbU6.3-R：CAGCCTGATGCTTCTGTTCTATC；(2)使用KODFX酶在20μl反应体系中进行PCR扩增；(3)将扩增产物TA克隆到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌Dh5α中并挑重组单克隆测序，即得546bp橡胶树U6基因启动子DNA片段proHbU6.3。6.根据权利要求5所述的克隆所述的橡胶树U6基因启动子proHbU6.3的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述PCR扩增步骤的反应程序为：95℃预变性2min，98℃变性10s，59℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃终延伸5min。7.一种构建权利要求3或4所述的橡胶树瞬时转化编辑载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)将克隆的启动子proHbU6.3构建到中间载体SK-5G上用SalI和XhoI双酶切SK-5G载体，回收2913bp载体骨架片段，设计如下引物分别在proHbU6.3序列和载体gRNA序列两端引入同源序列，将proHbU6.3和gRNA组装到SK-5G载体上得到proHbU6.3-SK-5G：...
【专利技术属性】
技术研发人员：辛士超，杨先锋，范月婷，戴雪梅，华玉伟，黄华孙，王春，王克剑，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院橡胶研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。