一种大豆叶特异启动子GmNR1(Glyma14g33480)及其分离方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种大豆叶特异启动子GmNR(Glyma14g33480)，具有SEQ ID NO 1所示的多核苷酸序列，大豆基因GmNR1能够在大豆叶中特异表达，在别的组织部位几乎不表达，大豆叶特异启高动子GmNR1在预防病虫害侵染大豆叶部中的应用。本发明专利技术提供的大豆叶特异启动子GmNR1可以在拟南芥叶中高效表达，在别的组织中几乎不表达；本发明专利技术提供的大豆叶特异启动子GmNR1在大豆根中不表达；本发明专利技术提供的大豆叶特异启动子GmNR1可以驱动抗病基因在模式植物拟南芥叶中高效表达，减少转基因对植株可食用部分的影响。

A soybean leaf-specific promoter GmNR1 (Glyma14g33480) and its isolation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种大豆叶特异启动子GmNR1(Glyma14g33480)及其分离方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种大豆叶特异启动子GmNR1及其分离方法和应用。
技术介绍
大豆作为重要的粮食作物，已有五千年栽培历史，广泛栽培于世界各地。大豆种子含有丰富的植物蛋白质、脂肪和多种营养元素，常用来做各种豆制品，豆油，酿造酱油等。大豆的生长环境比较恶劣，常常会遭受严重的外界病原微生物，害虫，营养缺乏和其他非生物胁迫，使其正常生长发育严重受到影响，甚至死亡，导致产量下降，品质恶化。例如，大豆花叶病毒(Soybeanmosaicvirus，SMV)病严重影响大豆的产量和种子的品质，在自然条件下每年可导致我国大豆8-50％的产量损失。然而，目前尚没有开发出有效且经济的方法来对付这些疾病，并且不同的病虫害会侵害大豆的不同组织，组成型启动子会使毒性蛋白在可食用也有部分表达。
技术实现思路
为了更有针对性地应对病虫害，需要在侵入组织表达目的基因，本专利技术的目的是提供一种大豆叶特异启动子GmNR1及其分离方法和应用。本专利技术是通过以下技术方案实现的。一种大豆叶特异启动子GmNR1，具有SEQIDNO1所示的多核苷酸序列。与所述的大豆叶特异启动子GmNR1互补的多核苷酸序列SEQIDNO2。上述大豆叶特异启动子GmNR1能够在拟南芥叶中特异表达，在别的组织部位几乎不表达，并且不能在大豆根中表达。本专利技术还提供一种大豆叶特异启动子GmNR1的分离方法，包括以下操作步骤：(1)根据已发表的大豆转录组数据，挑选出在叶表达量较高，而其他组织中表达量很低或根本没有表达的的基因；(2)根据候选基因的基因号在植物全基因组信息数据库Phytozome中查找到基因序列，并用Primer5软件设计RT-PCR引物，设计完成的引物在NCBI网站上进行比对，取只能比对到大豆mRNA数据库中一条模板的引物为最终采用的引物序列；(3)根据基因的基因编号，在植物全基因组信息数据库Phytozome中查找到候选基因上游2500bp的序列作为启动子的备选序列，对各序列进行酶切位点分析后，设计特异性引物扩增该启动子区，使最终克隆得到的启动子片段在2000bp，在正向引物和反向引物的5’端分别引入PstI酶切位点和BamHI酶切位点以及保护碱基。本专利技术提供了大豆叶特异启动子GmNR1在预防病虫害侵染大豆根部中的应用。由以上的技术方案可知，本专利技术的有益效果是：1.本专利技术提供的大豆叶特异启动子GmNR1可以在大豆叶中高效表达，在别的组织中几乎不表达；2.本专利技术提供的大豆叶特异启动子GmNR1在大豆根中不表达；3.本专利技术提供的大豆叶特异启动子GmNR1可以驱动抗病基因在大豆叶中高效表达，减少转基因对植株可食用部分的影响；4.本专利技术提供的大豆叶特异启动子GmNR1还可以用来调整期望的大豆性状，并开发对各种胁迫具有耐受性，增强的营养价值和先进的生产力的大豆品种。附图说明图1RT-PCR验证候选基因的表达模式，ACT11作对照；图2为大豆叶特异启动子GmNR1转化载体结构图谱；图3为转基因T1代拟南芥植株抗除草剂检测；图4为拟南芥转基因植株GUS染色情况；图5为大豆毛状根GUS染色情况。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不能用来限制本专利技术的范围。实施例中采用的实施条件可以根据厂家的条件作进一步调整，未说明的实施条件通常为常规实验条件。实施例1、根据已发表的大豆转录组数据，挑选出在叶表达量较高，而其他组织中表达量很低或根本没有表达的的基因，如表1所示：表1各基因在不同组织的表达量表2启动子序列的长度启动子编号序列长度(bp)GmNR1(Glyma14g33480)20702.RT-PCR验证大豆组织特异表达基因的表达模式根据候选基因的基因号在植物全基因组信息数据库Phytozome中查找到基因序列(https：//www.phytozome.net/)，并用Primer5软件设计RT-PCR引物，设计完成的引物在NCBI网站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)上进行比对，取只能比对到大豆mRNA数据库中一条模板的引物为最终采用的引物序列，如图2所示；3.根据基因的基因编号，在植物全基因组信息数据库Phytozome中查找到候选基因上游2500bp的序列作为启动子的备选序列，对各序列进行酶切位点分析后，设计特异性引物扩增该启动子区，使最终克隆得到的启动子片段在2000bp左右，在正向引物和反向引物的5’端分别引入PstI酶切位点和BamHI酶切位点以及保护碱基，得到的大豆叶特异启动子GmNR1转化载体结构图谱如图3所示；4.将根癌农杆菌感受态细胞从-80℃的冰箱中取出，置于冰上融化；取1μg质粒加入100uL农杆菌感受态细胞，在冰上放置30min；立即放入液氮中2min，37℃水浴5min；再放于冰上2min；在超净工作台中准备好无菌的2mL离心管，加入700μL未添加抗生素的LB液体培养基和农杆菌感受态；于28℃，200rpm的摇床中振荡培养4h；将菌液涂布于添加卡那霉素、壮观霉素和利福平的LB平板中，菌液晾干后，封盖倒置于28℃的培养箱中培养2天，直至长出单菌落。每种质粒挑取10个单菌落并用启动子特异性引物检测，检测正确的阳性克隆进行繁殖扩增，先放入20mL液体LB培养基中小摇，而后放在200mL液体培养基中大量繁殖(培养基中均已加入Kan，Rif，Spect抗性)；当菌液浓度达到OD600为1.5-3.0(菌液呈橙黄色)时，可将200mL菌液分装到4个无菌的50mL离心管中，室温下5000rpm离心10min，倒掉上清，保留菌体沉淀，用拟南芥侵染液(含0.02％silwet)吹打稀释菌液，至OD600为0.8-1.0左右，即可用于侵染，侵染前一天将待用的野生型拟南芥苗浇足量的水；每种质粒转化10株左右的野生型拟南芥，选取足量的花序形成至初花期的野生型拟南芥，将待侵染的植物剪去已长出的果荚和开放的花；将带有菌体的侵染液倒入小烧杯中，把拟南芥的地上部分浸入侵染液，侵染3min，取出后立即用保鲜膜包裹住植株，并平放遮光，待18h后即可将保鲜膜揭开(最好不要超过20h，以防植株萎蔫)，正常条件下继续培养即可。5.采用北京酷来博科技有限公司的GUS染色试剂盒对植物进行GUS组织化学染色，将1mLGUS染色浓缩液(50×)加入50mL的GUS染色缓冲液中(即稀释50倍)，混合均匀即配成GUS染液；将植物组织材料取出，并清洗干净，尤其注意植物根系的清洗，需用水缓慢将泥土冲洗干净，注意轻柔操作，以免伤及植物根系，将清洗好的植株放入平皿中；将90％丙酮加入平皿中，液面覆盖植物即可，在4℃中放置20min，固定材料，防止GUS信号扩散；倒掉丙酮，用GUS清洗液洗掉丙酮，重复清洗两次；将培养皿中的清洗液倒掉，加入GUS染色液，使染色液没过植物材料，用锡纸将培养皿包好，放入37℃培养箱中，经常观察植物染色情况，如果染上色了即可以进行脱色，也可以染色过夜；将染色液倒出，用移液枪吸净残留的染色液，加入70％乙醇，进行脱色，刚开始脱色要勤于更换乙醇，至少更换3-5次直至脱色完全(阴性对照材料呈白色)；脱色完成后，用镊子将植物材本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大豆叶特异启动子GmNR1，其特征在于，具有SEQ ID NO 1所示的多核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种大豆叶特异启动子GmNR1，其特征在于，具有SEQIDNO1所示的多核苷酸序列。2.与权利要求1所述的大豆叶特异启动子GmNR1互补的多核苷酸序列SEQIDNO2。3.根据权利要求1所述的一种大豆叶特异启动子GmNR1，其特征在于，所述大豆叶特异启动子GmNR1能够在拟南芥叶中特异表达，在别的组织部位几乎不表达，并且不能在大豆根中表达。4.一种如权利要求1所述的大豆叶特异启动子GmNR1的分离方法，其特征在于，包括以下操作步骤：(1)根据已发表的大豆转录组数据，挑选出在叶表达量较高，而其他组织中表达量很低或根本没有表达的的基因；(2)根据候选基因的基因号在植物全基因组信息数...

【专利技术属性】
技术研发人员：寻红卫，郭东全，庞劲松，钱雪艳，杨向东，于佳淼，刘宝，董英山，
申请(专利权)人：吉林省农业科学院，
类型：发明
国别省市：吉林,22