一种一对引物同时鉴别牛、羊源性成分的PCR检测试剂盒制造技术

技术编号:21908326 阅读:37 留言:0更新日期:2019-08-21 10:45
本发明专利技术提供了一种牛、羊源性成分快速检测试剂盒,属于动物种源性成分分子检测技术领域。本发明专利技术试剂盒包括一对特异性引物、反应试剂、空白对照以及牛阳性对照和羊阳性对照。本发明专利技术中所述牛包含普通牛、瘤牛、牦牛和水牛等,所述羊包括绵羊和山羊。所述的特异性引物是指一对引物能分别扩增牛特异性序列SEQ ID No.1和羊特异性序列SEQ ID No.2,且扩增产物片段大小不同(牛为125bp扩增片段,羊为107bp扩增片段),可通过扩增片段大小对牛和羊源性成分进行有效区分。采用本发明专利技术试剂盒进行分析,可判定样品中是否含有牛、羊源性成分。本发明专利技术为牛、羊源性成分的检测提供了直接、简便、可靠的检测方法,具有简便、快速、特异性强、适用性广且成本较低等特点。

A PCR Kit for Simultaneous Identification of Bovine and Sheep Origin Components with a Pair of Primers

【技术实现步骤摘要】
一种一对引物同时鉴别牛、羊源性成分的PCR检测试剂盒
本专利技术涉及动物分子生物学领域,具体涉及一对牛羊通用的特异性引物、试剂盒及其在牛羊源性成分鉴定中的应用。
技术介绍
食品、饲料和保健品等产品中动物源性成分,特别是牛、羊源性成分的检测是食品监管和市场管理部门的一项重要工作。为了防止疯牛病和羊痒病在我国的传播,在2017年修订并通过的《饲料和饲料添加剂管理条例》中规定,禁止在反刍动物饲料中添加除乳制品以外的动物源性成分。因此,为了打击食品掺假的违法行为和保障反刍动物饲料安全,开发一种有效的牛、羊源性成分检测技术是十分必要的。目前,我国用于食品和饲料中牛羊源性成分检测的专利有《一种鉴别牛羊猪源性成分的引物组及试剂盒-CN104789692A》、《检测饲料中牛羊成分的方法和试剂盒-CN1810988A》、《饲料中牛羊源成分检测方法及试剂盒-CN101775436A》和《一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR引物体系及检测方法-CN105177150A》等。上述专利可以在一定程度上实现食品或饲料中牛和羊源性成分的鉴定,但仍存在一些不足:(1)均须采用多对引物或加入荧光探针才能进行牛和羊中部分物种源性成分的鉴定,而且检测和分析过程繁琐、成本较高;(2)所检测的牛往往只局限于普通牛,而无法实现广义上的牛(含普通牛、瘤牛、牦牛和水牛等)的同时、等效检测,由此可能造成假阴性结果;(3)在进行方法的特异性验证中仅针对少数几个特定物种(通常为牛、羊、猪、鸡、鸭、马)进行试验验证和鉴别,鼠、狐、貉等物种未在其中,所以在方法的特异性上也存在疑问。因此,对食品和饲料中牛和羊源性成分,建立一种能通过一次PCR反应检测涵盖所有常见的牛(普通牛、瘤牛、牦牛和水牛)和羊(绵羊、山羊)的源性成分,且在牛、羊中特异(在牛羊以外的物种不被扩增或与牛羊扩增产物不同)又能进行区分(牛和羊的片段不同)的方法,这样可以使检测方法具有简便、快速、准确、低廉的特点。这样的检测方法是饲料和食品监管部门所急需的,可为饲料与食品行业的真实性与信誉保驾护航。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术不足,提供一对可同时鉴定和区分牛和羊源性成分的特异性检测引物;本专利技术的第二个目的在于提供用于牛羊源性制品检测和区分的检测试剂盒;本专利技术的目的还在于提供牛羊源性成分鉴定和区分的方法。为实现上述目的,本专利技术从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面进行特异DNA序列的筛选,经过猪、马、驴、鼠(大鼠、小鼠、仓鼠)、豚鼠、鸡、鸭、鹅、兔、狗、狐、水貂和貉的基因组DNA以及牛(包括普通牛、瘤牛、牦牛和水牛等)和羊(包括绵羊和山羊)的不同品种DNA中的检测,筛选在牛和羊中特异的、在其他物种中不存在或同源性低的DNA片段作为检测分子。此外,为了进一步简化检测过程和降低检测成本,所筛选序列在保证特异性的同时,应能有效区分牛和羊。经过大量分析和实验工作,最终获得可供检测使用的特异DNA序列,其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。基于此,本专利技术首先提供一对牛羊特异性引物,其能特异性扩增SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列或该序列的特异性片段。该特异性引物能特异性扩增牛特异性序列SEQIDNo.1和羊特异性序列SEQIDNo.2,且扩增序列大小不同(牛为125bp扩增片段,羊为107bp扩增片段),可通过扩增片段大小对牛和羊源性成分进行有效区分。优选地,引物长度为18~27bp。引物的设计需要考虑是否容易发生错配、扩增片段长度、反应温度等多方面。优选地,该引物序列如下:上游引物:5′-ATGGCTTAGGACCCAGCTCT-3′下游引物:5′-ACARCCAGAACCTGGATCGGA-3′;注:在引物合成过程中,碱基R按照简并碱基A/G进行合成。进一步,本专利技术提供含有上述特异性引物的检测试剂盒。优选地,所述试剂盒还包括下述试剂中的一种或多种:Taq酶、dNTPs、MgCl2、PCR缓冲液、阳性对照DNA模板、空白对照。所述阳性对照的模板为牛和羊的基因组DNA,所述空白对照的模板为双蒸水;进一步,本专利技术提供上述的牛羊特异性引物或检测试剂盒在牛和羊源性成分鉴定和区分中的应用。本专利技术还提供牛羊特异性引物、试剂盒及其在牛羊源性成分鉴定中的PCR检测方法,其步骤如下所述:1)提取样品基因组DNA;2)用上述的引物进行PCR扩增,并以牛和羊DNA模板为阳性对照,以双蒸水为空白对照;3)对PCR扩增产物进行检测和结果判定。优选地,其中步骤2)PCR扩增的反应体系如表1。表1本专利技术PCR扩增的反应体系PCR反应程序如下:95℃预变性5min;95℃变性30s,62℃退火30s,72℃延伸15s,共进行35次循环;72℃延伸3min;4℃保存。结果判定方法:牛和羊的阳性对照PCR反应中分别扩增出125bp和107bp的扩增片段,而空白对照中无扩增产物,表明PCR反应体系正常工作,否则重新检测;若牛特异性序列SEQIDNo.1得到扩增,且扩增片段大小与牛阳性对照的125bp片段大小一致,表明样品中检测出牛所述的特异性序列,表述为“样品中检测出牛源性成分”。若牛特异性序列未得到扩增,或扩增片段大小与牛阳性对照的125bp片段大小不一致,表明样品中未检测出牛所述的特异性序列,表述为“样品中未检测出牛源性成分”;若羊特异性序列SEQIDNo.2得到扩增,且扩增片段大小与羊阳性对照的107bp片段大小一致,表明样品中检测出羊所述的特异性序列,表述为“样品中检测出羊源性成分”。若羊特异性序列未得到扩增,或扩增片段大小与羊阳性对照的107bp片段大小不一致,表明样品中未检测出羊所述的特异性序列,表述为“样品中未检测出羊源性成分”;若牛特异性序列SEQIDNo.1和羊特异性序列SEQIDNo.2均得到扩增,且扩增片段大小分别为125bp和107bp,分别与牛和羊阳性对照的扩增大小一致,表明样品中检测出牛所述的特异性序列和羊所述的特异性序列,表述为“样品中同时检测出牛源性成分和羊源性成分”。若牛特异性序列SEQIDNo.1和羊特异性序列SEQIDNo.2均未得到扩增,或扩增片段大小与牛和羊阳性对照的片段大小均不一致,表明样品中未检测出牛和羊所述的特异性序列,表述为“样品中未检测出牛和羊源性成分”。本专利技术中检测结果可用琼脂糖凝胶电泳呈现;提取样品DNA的方法可用苯酚-氯仿提取法。本专利技术提供了有效的、精准的、可靠的牛和羊源性成分的分子鉴定方法,所组装的试剂盒能快速鉴定样品中是否含有牛和/或羊源性成分,并可根据扩增片段大小实现牛和羊源性成分的有效鉴别。本专利技术的方法可以在牛和羊源性成分检测中作为标准检测方法使用。本专利技术试剂盒及检测方法具有简便、快速、特异性强的特点,且成本较低,适用性广。附图说明图1是SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示核苷酸特异性序列在牛和羊中具有物种特异性的检测结果。以牛科牛亚科中的普通牛和水牛、牛科羊亚科中的绵羊和山羊,以及非牛科哺乳动物(小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、猪、马、驴、兔、狐、狗、水貂、貉)和非哺乳动物(鸡、鸭、鹅)的基因组DNA为模板,扩增SEQIDNo.1(牛特异性序列)和SEQIDNo.2(羊特异性序列)所示的特异片段,所有本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一对牛羊特异性引物,其能同时特异性扩增SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
2018.12.28 CN 20181161781061.一对牛羊特异性引物,其能同时特异性扩增SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的引物,其特征在于所述引物序列如下:上游引物:5′-ATGGCTTAGGACCCAGCTCT-3′下游引物:5′-ACARCCAGAACCTGGATCGGA-3′。3.含有权利要求1或2所述特异性引物的检测试剂盒。4.根据权利要求3所述的检测试剂盒,其特征在于,其还包括下述试剂中的一种或多...

【专利技术属性】
技术研发人员:刘榜王文君刘祖红周翔张庆德梁昱
申请(专利权)人:华中农业大学
类型:发明
国别省市:湖北,42

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