海藻酸裂解酶突变体制造技术

本发明专利技术涉及蛋白质工程改造技术领域，具体涉及一种海藻酸裂解酶突变体。本发明专利技术通过随机突变的方法筛选获得的海藻酸裂解酶突变体，其在枯草芽孢杆菌中的表达水平得到显著提高。重组表达野生型海藻酸裂解酶的枯草芽孢杆菌，其摇瓶发酵上清液酶活为488 U/ml，而重组表达海藻酸裂解酶突变体的枯草芽孢杆菌，其摇瓶发酵上清液高达635‑780 U/ml，提高了30%‑60%，取得了意料不到的技术效果。所述突变体的应用将有利于降低海藻酸裂解酶的生产成本，市场前景广阔。

Alginate lyase mutant

【技术实现步骤摘要】
海藻酸裂解酶突变体
本专利技术涉及蛋白质工程改造
，具体涉及一种海藻酸裂解酶突变体及其应用。
技术介绍
海藻酸是储量仅次于纤维素的海洋生物多糖。海藻酸存在于海藻的细胞壁和细胞间质中，在褐藻中的含量最为丰富，大多数巨型褐藻是海藻酸的潜在来源。但不同种类的褐藻，其所含海藻酸的性质不同，所以要根据褐藻的可用性及其海藻酸的性质来选择褐藻的来源。海藻酸主要的商业来源是泡叶藻、公牛藻、翅藻、海带、巨藻、马尾藻和喇叭藻，其中最重要的是海带、巨藻和泡叶藻。全球海藻酸的产地主要分布于沿海国家和地区，如挪威、美国、法国、中国、日本和韩国。目前，海藻酸降解的方法可分为三大类：一类是化学降解法，目前广泛采用的是碱水解法，这种方法存在污染环境且能耗较大的不足，同时碱水解对海藻中的有效物质有所破坏。此外，还有过氧化氢氧化降解法；第二类是物理降解法，例如超声降解海藻酸；第三类是海藻酸裂解酶酶解法，酶法降解海藻酸条件温和，过程可控，得率高，绿色安全，环境友好，作用机理明确，产物确定，可以根据具体目的产物要求选择单一或组合使用不同底物专一性的酶制剂。海藻酸裂解酶通过β消去反应裂解海藻酸的4-O-糖基键，同时在C-4和C-5之间形成双键，在产生的寡糖的非还原端产生4-deoxy-L-erythro-hex-4-enepyranosyluronate在230-240mm有强吸收峰。按底物的特异性，海藻酸裂解酶分为三种：第一种是聚甘露糖醛酸裂解酶，对polyM有特异性；第二种是聚古罗糖醛酸裂解酶，对polyG有特异性；第三种是对polyMG有特异性的裂解酶。按作用方式又可分为内切海藻酸裂解酶和外切海藻酸裂解酶。海藻酸裂解酶的来源广泛，主要有三大类，第一类是微生物，如海洋细菌、土壤细菌、真菌等；第二类是海洋软体动物和棘皮动物，如海螺、海参、鲍鱼等；第三类是植物，如巨藻、泡叶藻、海带等。目前，海藻酸裂解酶的生产大多是依靠海藻酸分解菌。虽然野生型海藻酸分解菌能有效的获得定量的酶蛋白，但产量很低成本较高，难达到实际应用要求。因此，利用基因工程手段对海藻酸裂解酶基因进行异源表达是提高海藻酸裂解酶产量的最有效途径。研究主要集中在海藻酸分解菌的海藻酸裂解酶基因的克隆和在大肠杆菌中过表达。目前，已有二十多种海藻酸分解菌的海藻酸裂解酶基因被克隆，而且其中大部分基因已成功地进行了异源表达。重组海藻酸裂解酶的表达量均高于野生菌株。1993年，Maki等研究人员，在大肠杆菌中表达了Pseudomonassp.OS-AIG-9的海藻酸裂解酶，其重组酶活性是野生菌株的53倍。近年来，随着蛋白质工程改造技术在酶制剂领域的广泛应用，新型的酶活水平高、性质优良的海藻酸裂解酶的开发成为本领域的研究热点，对于降低海藻酸裂解酶的生产成本，促进海藻酸裂解酶的产业化具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术问题，提供了一种新型的海藻酸裂解酶突变体，并构建得到重组表达该突变体的枯草芽孢杆菌工程菌株。与野生型海藻酸裂解酶相比，所述海藻酸裂解酶突变体在枯草芽孢杆菌中的表达水平得到明显提高，有利于大幅降低该酶的生产成本，市场前景广阔。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术提供了一种海藻酸裂解酶突变体，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)或（Ⅲ）所示的氨基酸序列中任意一个：(Ⅰ)与海藻酸裂解酶的氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少95%同源性的序列；(Ⅱ)具有所述(Ⅰ)中所述的海藻酸裂解酶的至少一个免疫表位，且所述海藻酸裂解酶的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；（Ⅲ）由如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列或其互补序列或因遗传密码的简并性而与如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列不同的序列编码的氨基酸序列；在本专利技术的另一些实施例中，所述取代为取代1个氨基酸。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括氨基酸序列为SEQIDNO:1的海藻酸裂解酶的第33，49，50，53，79，133，188，196，203，205，239，243，271位氨基酸中任意一个发生了取代。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第33位氨基酸由K变N。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第49位氨基酸由D变为N。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第50位氨基酸由K变为G。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第53位氨基酸由K变为R。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第79位氨基酸由P变为D。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第133位氨基酸由D变为N。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第188位氨基酸由K变为D。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第196位氨基酸由P变为S。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第203位氨基酸由E变为S。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第205位氨基酸由A变为S。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第239位氨基酸由L变为I。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第243位氨基酸由E变为K。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第271位氨基酸由K变为N。在本专利技术的另一些实施例中，所述海藻酸裂解酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:9，SEQIDNO:10，SEQIDNO:11，SEQIDNO:12，SEQIDNO:13，SEQIDNO:14，SEQIDNO:15所示。本专利技术还提供了编码上述氨基酸序列的DNA分子。本专利技术还提供了具有上述DNA分子的重组表达载体。本专利技术还提供了一种枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），包含上述重组表达载体。本专利技术还提供了所述枯草芽孢杆菌在生产海藻酸裂解酶中的应用。与野生型海藻酸裂解酶相比，本专利技术通过随机突变的方法筛选获得的海藻酸裂解酶突变体，其在枯草芽孢杆菌中的表达水平得到显著提高。重组表达野生型海藻酸裂解酶的枯草芽孢杆菌，其摇瓶发酵上清液酶活为488U/ml，而重组表达海藻酸裂解酶突变体的枯草芽孢杆菌，其摇瓶发酵上清液高达635-780U/ml，提高了30%-60%，取得了意料不到的技术效果。所述突变体在枯草芽孢杆菌中的高效表达将有利于降低海藻酸裂解酶的生产成本，市场前景广阔。具体实施方式本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,3ndEd.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体实施例的限定。本专利技术实施例中所述培养基中各组分及其含量分别为：LB平板：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl1%，琼脂1.5%；LB液体培养基：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl1%；1*最低盐溶液：K2HPO414g/L，KH2PO46g/L，（NH4）2SO42g/L，柠檬本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海藻酸裂解酶突变体，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)或（Ⅲ）所示的氨基酸序列中的任一个：(Ⅰ) 与海藻酸裂解酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的序列；(Ⅱ) 具有(Ⅰ)中所述海藻酸裂解酶的至少一个免疫表位，且所述海藻酸裂解酶的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；（Ⅲ）由如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列或因遗传密码的简并性而与如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列不同的序列编码的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种海藻酸裂解酶突变体，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)或（Ⅲ）所示的氨基酸序列中的任一个：(Ⅰ)与海藻酸裂解酶的氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少95%同源性的序列；(Ⅱ)具有(Ⅰ)中所述海藻酸裂解酶的至少一个免疫表位，且所述海藻酸裂解酶的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；（Ⅲ）由如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列或其互补序列或因遗传密码的简并性而与如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列不同的序列编码的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的海藻酸裂解酶突变体，其特征在于，所述的取代为取代1个氨基酸。3.如权利要求2所述的海藻酸裂解酶突变体，其特征在于，所述的取代包括氨基酸序列为SEQIDNO:1的海藻酸裂解酶的第33，49，50，53，79，133，188，196，203，205，239，243，271位氨基酸中任意一个发生了取代。4.如权利要求3所述的海藻酸裂解酶突变体，其特征在于，所述的取代...

【专利技术属性】
技术研发人员：许丽红，石增秀，周利伟，黄亦钧，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，潍坊康地恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37