一种新型壳聚糖酶CsnQ及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种新型壳聚糖酶CsnQ及其应用。所述壳聚糖酶CsnQ氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术提供一种壳聚糖酶CsnQ的制备方法，产量高达1058.2 U/mL。本发明专利技术所述壳聚糖酶CsnQ性质稳定，最适反应温度为60℃，在pH 4.0‑6.0之间保持稳定，40℃孵育1 h仍然保持61.2%的活性。降解方式为内切，降解主产物壳二糖和壳三糖。本发明专利技术所述壳聚糖酶CsnQ产量高、稳定性好，具有良好的工业化应用潜质。

A New Chitosanase CsnQ and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种新型壳聚糖酶CsnQ及其应用
本专利技术涉及一种新型壳聚糖酶CsnQ及其应用，属于生物

技术介绍
壳寡糖具有抗菌、抗肿瘤、抗炎等重要生物活性，被誉为“生命的第六元素”。壳寡糖是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖（GLcNAc）和D-氨基葡萄糖（GLcN）通过β-l,4-糖苷键连接而成，分子量小于3900，聚合度小于20，极易溶于水，在医药、保健品、食品、养殖等领域比大分子壳聚糖有更大的应用价值。壳寡糖是由大分子的壳聚糖降解而成。通常降解方法分为物理法、化学法和生物酶法降解三种类型。其中生物酶学降解具有反应条件温和、降解产物单一、反应过程容易控制、环境友好等优势。利用壳聚糖酶生物酶法降解大分子壳聚糖逐渐成为壳寡糖制备过程中的主流方法。但是，目前市场上销售的壳聚糖酶价格昂贵、活力较低，且稳定性较差，严重限制了壳聚糖酶的应用前景。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供了一种新型壳聚糖酶CsnQ及其制备方法。本专利技术所述壳聚糖酶CsnQ产量高达1058.2U/mL，最适反应温度为60℃，在pH4.0-6.0之间保持稳定，40℃孵育1h仍然保持61.2%的活性，多种金属离子对壳聚糖酶CsnQ的酶活具有促进作用。降解方式为内切，降解主产物为壳二糖和壳三糖。本专利技术所述壳聚糖酶CsnQ产量高、稳定性好，具有良好的工业化应用潜质。一方面，本专利技术提供一种新型壳聚糖酶CsnQ，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。SEQIDNO.1：MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMGVGGTGATHAGAAGSGVNLTDPHKKEIAMELVSSAENSSLDWKAQYKYIEDIGDGRGYTGGIIGFCSGTGDMLELVQHYTDLEPGNILAKYLPALKKVNGSASHSGLGTPFTKDWATAAKDTVFQQAQNDERDRVYFDPAVSQAKADGLRALGQFAYYDAIVMHGPGNDPTSFGGIRKTAMKKARTPAQGGDETTYLNAFLDARKAAMLTEAAHDDTSRVDTEQRVFLKAGNLDLNPPLHWKTYGDSYSINSLEHTTTPLRSGC另一方面，本专利技术还提供一种壳聚糖酶CsnQ对应的核酸序列，如SEQIDNO.2所示。SEQIDNO.2：ATGAAATACTTATTACCAACAGCAGCAGCAGGTTTATTATTATTAGCAGCACAACCAGCAATGGCAATGGGTGTAGGTGGTACAGGTGCAACACATGCAGGTGCAGCAGGTTCTGGTGTAAACTTAACAGATCCACATAAAAAAGAAATTGCAATGGAATTAGTATCTTCTGCAGAAAACTCTTCTTTAGATTGGAAAGCACAATACAAATACATTGAAGATATTGGTGATGGTCGTGGTTACACAGGTGGTATTATTGGTTTCTGTTCTGGTACAGGTGATATGTTAGAATTAGTACAACATTACACAGATTTAGAACCAGGTAACATTTTAGCAAAATACTTACCAGCATTAAAAAAAGTAAACGGTTCTGCATCTCATTCTGGTTTAGGTACACCATTCACAAAAGATTGGGCAACAGCAGCAAAAGATACAGTATTCCAACAAGCACAAAACGATGAACGTGATCGTGTATACTTCGATCCAGCAGTATCTCAAGCAAAAGCAGATGGTTTACGTGCATTAGGTCAATTCGCATACTACGATGCAATTGTAATGCATGGTCCAGGTAACGATCCAACATCTTTCGGTGGTATTCGTAAAACAGCAATGAAAAAAGCACGTACACCAGCACAAGGTGGTGATGAAACAACATACTTAAACGCATTCTTAGATGCACGTAAAGCAGCAATGTTAACAGAAGCAGCACATGATGATACATCTCGTGTAGATACAGAACAACGTGTATTCTTAAAAGCAGGTAACTTAGATTTAAACCCACCATTACATTGGAAAACATACGGTGATTCTTACTCTATTAACTCTTTAGAACATACAACAACACCATTACGTTCTGGTTGT另一方面，本专利技术还提供一种壳聚糖酶CsnQ的制备与纯化方法。另一方面，本专利技术还提供了所述壳聚糖酶CsnQ在降解壳聚糖中的应用。另一方面，一种降解壳聚糖的方法，所选用的壳聚糖酶为CsnQ。优选：所述降解条件中反应温度为0~80℃。最适反应温度为60℃。优选：所述降解条件中反应pH为4.0~9.6。最适反应pH为5.0。有益效果：1.本专利技术的壳聚糖酶CsnQ为新颖的壳聚糖酶，其保守区与已有结构报道的壳聚糖酶（PDB：1CHK）氨基酸序列相似度为96.63%，基本一致，使得其保持了良好的催化活性（比活力达到690.5U/mg）；本专利技术所述壳聚糖酶CsnQ与已有结构报道的壳聚糖酶（PDB：1CHK）序列差异主要表现为：壳聚糖酶CsnQ包含有287个氨基酸序列，而壳聚糖酶（PDB：1CHK）只包含有238个氨基酸序列。本专利技术所述壳聚糖酶CsnQ的N端包含一段39个氨基酸（Met1-Gly39）组成的N-trunk结构，其C段包含9个氨基酸的C-tail结构（His278-Cys287）。两者包含有多种刚性氨基酸，增加了壳聚糖酶的三维结构的刚性，是其具有较好稳定性的结构基础。2.本专利技术提供了一种制备壳聚糖酶CsnQ的方法，即利用基因工程的技术方法，将壳聚糖酶CsnQ的基因序列异源重组表达到大肠杆菌，经发酵后，发酵液酶活力高达1058.2U/mL，具有工业化生产的潜质。该酶纯化方法简单，利用镍柱对其进行一步亲和纯化，回收率高达79.6%，蛋白质纯度高达95%。3.本专利技术的壳聚糖酶CsnQ具有优良的理化性质，最适pH为5.0，在pH4.0-6.0范围内保持稳定，40℃孵育1h仍然保持61.2%的活性，多种金属离子对壳聚糖酶CsnQ的酶活具有促进作用。降解方式为内切，降解主产物壳二糖和壳三糖。本专利技术所述壳聚糖酶CsnQ产量高、稳定性好，具有良好的工业化应用潜质。附图说明图1为本专利技术壳聚糖酶CsnQ与已知壳聚糖酶序列之间的进化关系结果；图2为本专利技术壳聚糖酶CsnQ的蛋白质分离纯化图（M，蛋白质标准品；1，纯化前样品，2，纯化所得壳聚糖酶CsnQ）；图3为本专利技术壳聚糖酶CsnQ的温度和pH适应性分析（A，壳聚糖酶CsnQ的最适反应温度；B，壳聚糖酶CsnQ的温度稳定性；C，壳聚糖酶CsnQ的最适反应pH；D，壳聚糖酶CsnQ的pH稳定性）；图4为薄层层析（TLC）法检测本专利技术壳聚糖酶CsnQ的降解方式和酶解产物（M，壳寡糖DP1-4，壳寡糖1-4糖标准品）；图5为阴离子一级质谱法检测本专利技术壳聚糖酶CsnQ的降解产物。具体实施方式实施例1壳聚糖酶CsnQ的序列分析本专利技术所述壳聚糖酶CsnQ的产酶基因csnQ为人工合成序列。前期研究中，我们发现海洋细菌Vibriosp.Q108具有较高的壳聚糖酶活性，对其进行全基因测序时，发现其含有一个预测的壳聚糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型壳聚糖酶CsnQ，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种新型壳聚糖酶CsnQ，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的壳聚糖酶CsnQ所对应的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.如权利要求1所述的壳聚糖酶CsnQ的制备与纯化方法。4.如权利要求1所述的壳聚糖酶CsnQ在降解壳聚糖中的应...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨文钰，
申请(专利权)人：山东昊岳医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37