一种昆虫解毒酶蛋白在降解有机磷农药中的应用制造技术

本发明专利技术属于昆虫解毒酶在农药降解中的应用，具体是飞蝗解毒酶LmGSTpcF1在降解马拉硫磷农药中的应用，所述飞蝗解毒酶LmGSTpcF1的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列。LmGSTpcF1与GSH和马拉硫磷在反应条件下进行孵育，通过液相色谱法检测马拉硫磷，结果表明马拉硫磷基本被完全降解，检测不到农药成分残留，降解效率达到99％以上。本发明专利技术飞蝗解毒酶LmGSTpcF1可用于农产品、水源、土壤等中的马拉硫磷农药残留去除。

Application of an insect detoxifying enzyme protein in degradation of organophosphorus pesticides

【技术实现步骤摘要】
一种昆虫解毒酶蛋白在降解有机磷农药中的应用
本专利技术涉及昆虫解毒酶在农药降解中的应用，具体涉及昆虫谷胱甘肽-S转移酶蛋白在马拉硫磷降解中的应用。
技术介绍
在我国，由于马拉硫磷(malathion)具有高效、低毒及杀虫广谱性等优势，被广泛用于害虫防控。由于马拉硫磷作用靶标为乙酰胆碱酯酶(AChE)，可影响到哺乳动物及人类的神经系统，从而产生危害。长期不合理过量使用马拉硫磷，不但使得环境中其农药残留大幅增加，而且致使昆虫出现杀虫剂抗性，进一步导致农药的泛滥使用。长此以往，环境中的马拉硫磷农药残留将影响到食品安全与人们的健康，需要对其进行无害化处理。如何绿色、高效的去除农药残留？利用生物解毒酶被认为是可行途径之一。在公开号CN103170089的专利中，公开了一种微生物谷胱甘肽-S转移酶在降解多种农药中的应用，其结果显示该生物解毒酶对高效氯氰菊酯、戊唑醇、二甲戊乐灵、S-氰戊菊酯有较为明显降解效率。但该酶对马拉硫磷并不降解，无法解决去除马拉硫磷农药残留这一问题，需要寻找其他方法解决。针对这一问题，申请人将目光聚焦于昆虫上。昆虫抗药性的产生常因其可有效代谢农药。因而昆虫的代谢解毒酶具有发展为去除农残生物酶的潜力。昆虫体内有三大代谢解毒酶系，即羧酸酯酶、细胞色素单加氧酶和谷胱甘肽-S转移酶，每个酶系都是拥有多达几十个成员的家族酶。并非每个代谢酶都以不同的机制参与不同农药的降解。在如此庞大的昆虫代谢解毒酶系中，如何获得高效降解马拉硫磷的解毒酶是整个问题的关键。申请人经过长期调研发现，我国黄骅地区长期使用马拉硫磷防治飞蝗(Locustamigratoria)，该地区飞蝗已对马拉硫磷产生抗性。进一步研究敏感品系飞蝗和抗性品系飞蝗显示，后者的谷胱甘肽-S转移酶酶活显著性提升。对抗性品系飞蝗谷胱甘肽-S转移酶家族基因进行分析研究，则有很大概率发现对马拉硫磷具有极高代谢能力的解毒酶。本专利技术即在此研究基础上提供一种高效降解马拉硫磷农药的昆虫解毒酶。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种飞蝗解毒酶LmGSTpcF1在降解马拉硫磷农药中的应用。本专利技术提供的飞蝗解毒酶LmGSTpcF1在降解马拉硫磷农药中的应用，所述飞蝗解毒酶LmGSTpcF1的氨基酸序列为SEQIDNO：2所示的序列。编码该飞蝗解毒酶的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO：1所示的序列。本专利技术所述飞蝗解毒酶基因LmGSTpcF1从抗性品系飞蝗中克隆得到，其核苷酸序列为SEQIDNO：1所示的序列。使用大肠杆菌原核表达后获得氨基酸序列为SEQIDNO：2的纯化蛋白LmGSTpcF1。本专利技术的有益效果：LmGSTpcF1与GSH和马拉硫磷在反应条件下进行孵育，通过液相色谱法检测马拉硫磷，结果表明马拉硫磷基本被完全降解，检测不到农药成分残留，降解效率达到99％以上。本专利技术飞蝗谷胱甘肽-S转移酶LmGSTpcF1可用于农产品、水源、土壤等中的马拉硫磷农药残留去除。附图说明图1为LmGSTpcF1蛋白纯化电泳图，其中：M、10-180kDa蛋白分子量标准；1、未纯化的LmGSTE4总蛋白；2-3、过柱穿透液；4-13、20-250mM咪唑缓冲液洗脱组分；黑色箭头所指位置为目的蛋白。图2为LmGSTpcF1对马拉硫磷代谢色谱图，其中：A、LmGSTpcF1+2.5mMGSH+马拉硫磷；B、PBS+2.5mMGSH+马拉硫磷。具体实施方式实施例1：飞蝗LmGSTpcF1基因获得以抗性品系飞蝗cDNA为模板，利用引物：FF5’-3’：ATGCCAGTCACCCTC，与FR5’-3’：CTACGGAGCCAGATG克隆获得LmGSTpcF1全长基因，体系为：2×TaqPCRMasterMix(25μL)，DNA模板(1μL)，引物(各1μL)，ddH2O(21μL)，共50μL。产物经回收、纯化和测序后，获得SEQIDNO：1。实施例2：LmGSTpcF1的表达与纯化依据SEQIDNO：1，设计包含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的引物，WF5’-3’：TAGGATCCATGCCAGTCACCCTC和WR5’-3’：ATAAGCTTCTACGGAGCCAGATG用于重组质粒构建。经PCR后，产物加入BamHⅠ和HindⅢ进行酶切，并利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳回收。原核表达载体pET28a也同步处理。将回收产物混合后，加入缓冲液和T4连接酶，经4℃过夜连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。挑选验证结果准确无误的菌株，扩大培养，提取重组质粒，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。挑取阳性菌落，PCR验证后，扩大培养。将阳性单克隆菌落接种于液体LB培养基(含50μg·mL-1卡那霉素)试管中，在37℃、200r/min的振荡培养箱中培养14—16h，作为种子菌液。按1﹕100的比例吸取种子菌液接种于液体LB培养基中(含50μg·mL-1卡那霉素)，置于37℃培养至OD600≈0.6，加入IPTG(终浓度为0.5mmol·L-1)，置于16℃培养，诱导目标蛋白大量表达；20h后，离心收集菌体沉淀，经PBS(0.1mol·L-1，pH7.0)清洗3遍；加入PBS20mL，置于冰上超声破碎至溶液透亮。12000r/min，4℃离心30min，收集上清即为粗酶液。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定成功表达后，使用HisTrapFF预装柱，通过pure蛋白纯化系统进行纯化。用含有不同浓度咪唑(20—250mmol·L-1)的缓冲液洗脱。对粗蛋白及不同洗脱组分进行电泳检测，对含有较单一目的条带的洗脱组分通过PBS缓冲液进行超滤，最终获得序列为SEQIDNO：2的纯化蛋白。经测定其浓度为1.6mg/mL。实施例3LmGSTpcF1对马拉硫磷的代谢检测使用HPLC检测农药的峰面积来计算LmGSTpcF1对马拉硫磷的代谢程度。色谱检测条件为流动相A为乙腈，B为0.1％甲酸水。洗脱梯度为A:B＝80:20等度洗脱8min；检测波长210nm；柱温35℃；上样量2uL；流速0.2mL/min。检测样品分为A、B两组。A组为正常反应组(LmGSTpcF1+GSH+马拉硫磷)；B组以PBS缓冲液代替蛋白，为无蛋白对照组(PBS+GSH+马拉硫磷)。200uL反应液包括：20uL1.6mg/mLLmGSTpcF蛋白(32ug)；15uL20mg/mL马拉硫磷(300ug)，10uL50mMGSH(2.5mM)，PBS补足体积到200uL。反应液混匀后，置于27℃，1200r/min，温育3h；反应结束后加入400μL乙腈，27℃，1200r/min，温育5min终止反应；将样品于13000r/min，室温离心20min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后转移至1.5mL色谱瓶，上样2ul进行检测。每个样品均平行制备3份，之后对不同组马拉硫磷峰面积变化通过Studentt-test进行显著性分析。结果如表1所示，A处理组检测不到马拉硫磷的峰，降解率达到99.3％。这说明LmGSTpcF1对马拉硫磷具有很好的代谢能力，可用于马拉硫磷农残处理。表1：马拉硫磷峰面积检测结果组别马拉硫磷峰面积均值标准偏差A,LmGSTpcF1+GSH+马拉硫磷0.420.01B,PBS+GSH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.飞蝗解毒酶LmGSTpcF1在降解马拉硫磷农药中的应用，所述飞蝗解毒酶LmGSTpcF1的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列。

【技术特征摘要】
1.飞蝗解毒酶LmGSTpcF1在降解马拉硫磷农药中的应用，所述飞蝗解毒酶LmGSTpcF1的氨基酸序列为SEQIDNO：...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建琴，马雯，乔玉琪，秦雪梅，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西,14