本发明专利技术公开了一种S‑腺苷甲硫氨酸合成酶突变体及其制备方法，该突变体是将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第65位、第104位、第186位进行单点、双点或三点突变而获得。与野生型S‑腺苷甲硫氨酸合成酶相比，该突变体在10mM底物反应体系中SAM最终积累量增加1.06mM。同时，该突变体比酶活相比于野生型eMAT增加3.3倍，为6.02±0.22U/mg。这进一步为SAM的酶法制备提供了可能性，也为分子改造改善酶的产物抑制现象提供了思路。
A mutant of S-adenosylmethionine synthase and its preparation method
【技术实现步骤摘要】
一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体及其制备方法
本专利技术涉及一种催化活性提高且产物抑制降低的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体及其制备方法，属于基因工程领域。
技术介绍
S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是一种重要的生理活性物质，参与生物体内转甲基、转硫基、转氨丙基等多种生化反应。临床上，SAM对治疗肝炎、抑郁症、关节炎等具有显著的治疗效果，因此市场需求量巨大。目前，SAM主要通过微生物发酵法生产，但该法存在生产周期长、底物转化率低、提取过程复杂、产物易发生自消旋等问题。相比较而言，酶催化法具有反应时间短、立体选择性高、提纯过程较简单等特点。S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethioninesynthetase，简称MAT，EC2.5.6.1)，催化ATP和L-甲硫氨酸生成SAM，同时生成副产物正磷酸和焦磷酸。通过比较不同来源MAT的酶学性质，我们发现来源于大肠杆菌的MAT(eMAT)具有蛋白表达量较高、比酶活较高、Km较小等优势。但该酶也存在严重的产物抑制现象，导致酶催化效率低，SAM无法有效积累。虽然加入高浓度对甲苯磺酸钠能够克服产物抑制，但SAM对甲苯磺酸钠成品作为药物时存在生物利用率低的问题。因此，通过酶的分子改造而非加入对甲苯磺酸钠来降低eMAT的产物抑制现象在酶法制备SAM中具有重要意义。目前，已有一些通过分子改造改善MAT催化性能的报道。Dippe等对来源于枯草芽孢杆菌的MAT进行理性设计时发现，将317位异亮氨酸突变为缬氨酸时能增加MAT的催化活性，同时降低产物抑制现象(Chem.Commum(Camb).51(2015)3637-3640)(USPatent20160264945A1)。以此为基础，Yin等对来源于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的MAT进行同源序列对比后，将eMAT的303位异亮氨酸突变为缬氨酸，eMAT的酶活和产物抑制现象均有所改善(Molecules22(2017)1365-1377)。另外，Hu等人利用DNAshuffling技术对来源于大肠杆菌、酿酒酵母和壮观链霉菌的MAT基因进行重组，获得两株酶活提高、SAM积累量也增加的菌株GS115/DS56和GS115/DS16，并对突变株进行了序列分析(表1)(J.Biotechnol.141(2009)97-103)。其中，GS115/DS56MAT氨基酸序列与酿酒酵母SAM2(酿酒酵母MAT的特称)氨基酸序列同源率为99％，GS115/DS16MAT氨基酸序列与壮观链霉菌MAT(sMAT)序列同源率为98％。将原核生物和真核生物的MAT氨基酸序列进行比对发现，MAT属于高保守型蛋白家族，尤其是活性中心的位点。因此，可以通过定点突变和半理性设计对eMAT进行分子改造。表1pDS56和pDS16的突变位点
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体、编码基因、重组载体、重组菌以及其在酶法制备SAM中的应用。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，所述突变体是将SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第65位、第104位、第186位进行突变获得。进一步，先将303位异亮氨酸突变为缬氨酸(I303V),再在单点突变的基础上将65位异亮氨酸突变为缬氨酸(I303V/I65V),接着在两点突变的基础上将186位亮氨酸突变为缬氨酸(I303V/I65V/L186V),最后在三点突变的基础上将104位天冬酰胺突变为赖氨酸(I303V/I65V/L186V/N104K)。更进一步，所述突变体氨基酸序列为下列之一：SEQIDNO.2，SEQIDNO.3，SEQIDNO.4。本专利技术还涉及一种编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体的基因。本专利技术还涉及一种携带所述基因的重组载体。本专利技术还涉及一种由重组载体转化制备的重组菌。本专利技术提供一种所述S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体在酶法合成SAM中的应用。与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术构建了一种高效表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体的重组大肠杆菌；该重组大肠杆菌表达的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体比酶活比野生型eMAT提高3.31倍，为6.02±0.22U/mg；在10mM底物反应体系中，该突变体可以使SAM最终积累量为2.68mM，而野生型eMATSAM积累量仅为1.62mM。附图说明图1metK基因片段核酸电泳图，1泳道为DNAMaker，2泳道为metK基因PCR扩增产物。图2E.coliK12来源MAT与文献报道MAT氨基酸序列比对结果。图3野生型重组菌SDS-PAGE电泳图，泳道1为蛋白Maker，泳道2为全细胞破胞蛋白，泳道3为破胞液上清蛋白，泳道4为破胞液沉淀蛋白。图4S-腺苷甲硫氨酸合成酶eMAT野生型与突变体在不同底物浓度下SAM积累量变化曲线。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行描述，但本专利技术的保护范围并非仅限于此：实施例1：S-腺苷甲硫氨酸合成酶重组菌的构建选取EscherichiacoliK12来源的S-腺苷甲硫氨酸合成酶，利用PCR技术，以E.coliK12基因组为模板，以metK-F:5’-GATCCGAATTCATGGCAAAACACCTTTTTACG-3’(SEQIDNO.5)和metK-R:5’-GTGCTCGAGTTACTTCAGACCGGCAGCAT(SEQIDNO.6)为引物，对metK基因进行扩增，并在其5’端和3’端分别引入EcoRI和XhoI限制性内切酶酶切位点(下划线标出)。PCR反应体系(50μL)为：2×PrimeSTARMaxPremix25μL，模板DNA1μL，上下游引物各1μL，无菌水22μL。PCR反应条件为：98℃预变性5min；98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸10s，循环30次；72℃延伸5min。以1％琼脂糖凝胶电泳验证PCR扩增产物，当目的条带大小符合编码SEQIDNO.1大小时(图1)，用PCR产物回收试剂和进行产物回收。将纯化后的PCR产物和质粒pET-28a(+)分别同时用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行双酶切反应。酶切结束后，将酶切产物进行大孔琼脂糖凝胶电泳，并从核酸胶上切下正确的条带用于DNA胶回收。回收后的片段测定浓度后按照摩尔比3：1(目的基因：质粒)进行酶连反应。接着，通过热激法将酶连产物转入到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，获得重组菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-metK。实施例2：S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的单点突变将实施例1中的重组菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-metK培养过夜后提取重组质粒pET-28a(+)-metK，并以其为模板，对303位进行定点突变。定点突变用FastMutagenesissystem试剂盒，以I303V-F:5’-TCAGGTTTCCTACGCAGTCGGCGTGGC-3’(SEQIDNO.7)和I303V-R:5’-CCAGAAGGCACTTTCTCAGTACCGAAAG-3’(SEQIDNO.8)为引物，进行全质粒PCR扩增(94℃5min；94℃20s，60℃20s，72℃60s，循环30次；72℃10min)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证后用本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种S‑腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，其特征在于，所述S‑腺苷甲硫氨酸合成酶突变体是将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第65位进行突变获得；或者将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第65位、第186位同时进行突变获得；或者将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第65位、第104位、第186位同时进行突变获得。
【技术特征摘要】
1.一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，其特征在于，所述S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体是将如SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第65位进行突变获得；或者将如SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第65位、第186位同时进行突变获得；或者将如SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第65位、第104位、第186位同时进行突变获得。2.根据权利要求1所述S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，其特征在于所述氨基酸序列的第65位异亮氨酸突...
【专利技术属性】
技术研发人员：林建平，王秀，朱力，蒋亦琪，孙志娇，吴绵斌，杨立荣，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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