一种ω-转氨酶双突变体及其应用制造技术

技术编号:21908306 阅读:118 留言:0更新日期:2019-08-21 10:45
本发明专利技术公开了一种ω‑转氨酶双突变体及其应用,该ω‑转氨酶双突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术ω‑转氨酶双突变体由野生型的土曲霉(Aspergillus terreus)ω‑转氨酶第115位的苯丙氨酸突变成亮氨酸,第118位的亮氨酸突变成苏氨酸而获得;该ω‑转氨酶双突变体的半失活温度比野生型提高了8.8℃,热解折叠温度比野生型提高了7.7℃,在40℃时的半衰期较野生型延长了59.0min,是野生型的9.55倍。

A Double Mutant of_-aminotransferase and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种ω-转氨酶双突变体及其应用
本专利技术涉及分子生物学
,尤其涉及一种ω-转氨酶双突变体及其应用。
技术介绍
胺转氨酶(ATAs)以其高立体选择性和环境温和的反应条件,成为制备光学纯手性胺最主要的生物催化剂。一般来说,提高温度可以增加原料与产物的溶解度降低其粘度,加快反应速度,但天然状态下的酶的温度耐受性差,高温易使酶失活变性,如何提高酶的热稳定性是蛋白质工程极具挑战性的研究。由MichaelSmith专利技术兴起的定点突变技术,是在已知的基因序列中插入、取代和缺失特定核苷酸,从而改变蛋白质一级结构。张晓凤等(张晓凤.定点突变提高土曲霉Aspergillusterreus脂肪酶的催化活性[J].生物工程学报,2018,34(7):1091-1105)对酸性脂肪酶底物结合口袋附近和Lid区域的位点进行突变,获得了催化活性显著提高的ATLV218W和ATLLid突变体。定点饱和突变技术提升了点突变的可能性,能将某个预测功能位点同时替换成其它19种氨基酸。通过设计简并引物构建饱和突变文库因突变子数量庞大需要简单灵敏的高通量筛选方法以获得有效突变体。例如:林玲等(林玲.利用定向进化及半理性设计提高谷氨酸脱羧酶催化活性的研究[D].浙江:浙江大学,2013)对GAD1407谷氨酸脱羧酶的第51位点构建饱和突变文库,并采用郁凯等(YuK,HuS,HuangJ,MeiLH.Ahigh-throughputcolorimetricassaytomeasuretheactivityofglutamatedecarboxylase[J].EnzymeMicrob.Technol,2012,49(3):272-276)根据溴甲酚紫指示剂能反映谷氨酸脱羧酶催化底物脱羧引起体系pH值变化,而建立了通过观察颜色的深浅来判断谷氨酸脱羧酶活性高低的高通量筛选方法,最终筛选获得突变体Q51H,其催化活性是野生型的2.2倍。申请公布号为CN109486778A的专利技术专利申请公开了一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用,该ω-转氨酶突变体的第118位氨基酸由亮氨酸突变为丙氨酸或苏氨酸,与野生型相比,ω-转氨酶突变体的半失活温度提高3.7℃和5.3℃,半衰期延长13.7min和19.1min。然而,单突变位点的突变对酶活稳定性的改善是有限的,为了进一步的提高转氨酶的热稳定性,需要在其他位点引入突变。
技术实现思路
本专利技术提供了一种ω-转氨酶双突变体,在利用蛋白质共进化网络预测高交联残基位点的基础上,结合迭代饱和突变技术,构建迭代饱和突变文库,筛选获得双突变体L118T-F115L,该双突变体的Tm和T5010相比于野生型分别提高了7.7℃和8.8℃,其40℃时的t1/2较野生型延长了59.0min。具体技术方案如下:本专利技术提供了一种ω-转氨酶双突变体,其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。上述双突变体是由野生型的土曲霉(Aspergillusterreus)ω-转氨酶第115位的苯丙氨酸(密码子TTT)突变成亮氨酸(密码子CTA),第118位的亮氨酸(密码子TTG)突变成苏氨酸(密码子ACG)而获得的,称为L118T-F115L双突变体。本专利技术首先通过分析转氨酶氨基酸残基间的共进化关系,筛选获得8个具有共进化关系的氨基酸位点,建立相应的突变文库,发现L118T突变体具有较高的活性,再以L118T突变体为起点,构建迭代饱和突变文库;从近900个突变子中筛选出来最佳双突变组合L118T-F115L。该双突变体L118T-F115L的稳定性分析结果表明,其T5010值较野生型提高了8.8℃,t1/2是野生型的9.55倍。对该组合突变酶的热解折叠温度进行测定,其Tm值较野生型提高了7.7℃,突变使蛋白的刚性得到加强。无论是动力学稳定性还是热力学稳定性结果一致表明,双突变L118T-F115L的热稳定性有大幅的提高。本专利技术还提供了编码所述ω-转氨酶双突变体的基因。编码所述ω-转氨酶双突变体基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供了一种包含所述基因的表达单元。本专利技术还提供了一种包含所述表达单元的重组质粒。本专利技术还提供了一种包含所述重组质粒的基因工程菌。可以将目的基因片段整合到基因工程菌的基因组上,以获得稳定表达的ω-转氨酶双突变体的基因工程菌,也可以通过质粒的形式存在。可以选择常用的用于蛋白表达的基因工程菌,优选为E.coliBL21(DE3)。本专利技术提供的ω-转氨酶双突变体能够以(R)-(+)-α-甲基苄胺和丙酮酸为底物催化发生转氨反应生成苯乙酮,手性选择性为(R)型。本专利技术还提供了所述ω-转氨酶双突变体或所述基因工程菌在催化(R)-(+)-α-甲基苄胺中的应用。与现有技术相比,本专利技术具有以下有益效果:本专利技术ω-转氨酶双突变体由野生型的土曲霉(Aspergillusterreus)ω-转氨酶第115位的苯丙氨酸突变成亮氨酸,第118位的亮氨酸突变成苏氨酸而获得的;该ω-转氨酶双突变体的半失活温度比野生型提高了8.8℃,热解折叠温度比野生型提高了7.7℃,在40℃时的半衰期较野生型延长了59.0min,是野生型的9.55倍。附图说明图1为实施例1中ω-转氨酶(PDBID:4CE5)与其同源蛋白家族序列利用蛋白质共进化网络互信息预测的重要位点图。图2为实施例1中L118T-F115位点迭代饱和突变文库的初筛示意图。图3为实施例1中L118T-F115L双突变体的SDS-PAGE分析;其中,1为粗酶液;2为穿透液;3为20mM咪唑洗脱液;4为50mM咪唑洗脱液;5为100mM咪唑洗脱液;6为250mM咪唑洗脱液。图4为实施例2中L118T-F115L双突变体的动力学稳定性分析;其中,A为酶液在不同温度下孵育10min后测得的T5010值;B为40℃下酶液保温不同时间时的残余酶活;Residualactivity表示剩余活力;Temperature表示温度。图5为实施例2中差示荧光扫描法测定转氨酶及其突变酶的热解折叠情况;其中,Relativefluorescence表示相对荧光;Temperature表示温度。图6为实施例2中酶催化底物的动力学曲线;其中,A为底物丙酮酸浓度为2.5mM时,R-MBA的浓度(0-4.0mM);B为底物R-MBA浓度为2.5mM时,丙酮酸的浓度(0-4.0mM)。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步描述,以下列举的仅是本专利技术的具体实施例,但本专利技术的保护范围不仅限于此。实施例11、共进化网络预测蛋白质共进化对于洞悉功能蛋白质的作用过程和蛋白质结构具有重要意义。通过对蛋白质共进化的度量,可以找到对蛋白质结构和功能具有重要作用的残基位点。具体步骤如下:(1)将土曲霉(Aspergillusterreus)ω-转氨酶的PDB文件(PDBID:4CE5)在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中通过BLASTP多序列比对,获得相关的蛋白质家族编号pfam:01063。(2)以互信息(MutualInformation,MI)为基础,通过不同生物学特征,借助互信息推断蛋白共进化网站MISTIC(MutualInformationServerToInfe本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种ω‑转氨酶双突变体,其特征在于,氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种ω-转氨酶双突变体,其特征在于,氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.编码如权利要求1所述ω-转氨酶双突变体的基因。3.如权利要求2所述的基因,其特征在于,所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.一种包含权利要求2或3所述基因的表达单元。5.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员:黄俊梅乐和吕常江朱婉丽王宏鹏胡升赵伟睿
申请(专利权)人:浙江科技学院
类型:发明
国别省市:浙江,33

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