杂交瘤细胞株6B1及其分泌的抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体与应用制造技术

本发明专利技术公开了杂交瘤细胞株6B1及其分泌的抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体与应用，属于生物技术领域。该杂交瘤细胞株能持续、稳定分泌抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体，利用该单克隆抗体能够特异性地识别口蹄疫A型病毒多种毒株，并具有高特异性、高灵敏度的优点。基于该单克隆抗体的胶体金试纸条和测试卡以及间接ELISA法试剂盒检测口蹄疫A型病毒的抗原或抗体特异性好、灵敏度高。本发明专利技术可在口蹄疫A型病毒的检测、疫苗生产质量监控、流行病学研究中发挥重要作用，应用前景广阔。

Hybridoma cell line 6B1 and its secreted monoclonal antibodies against foot-and-mouth disease virus A and their application

【技术实现步骤摘要】
杂交瘤细胞株6B1及其分泌的抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体与应用
本专利技术属于生物
中的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体与应用，特别是涉及杂交瘤细胞株6B1及其分泌的抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体以及该抗体在检测口蹄疫A型病毒抗体和抗原中的应用。
技术介绍
口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性、接触性传染病，最易感染的动物是牛、猪、羊等。由于口蹄疫传播迅速、难于防治、补救措施少，被称为畜牧业的“头号杀手”。我国对口蹄疫的预防主要通过疫苗预防接种，发生口蹄疫的则被捕杀。FMDV有7个血清型，各型之间几乎没有交叉保护力，感染了其中一型口蹄疫病毒的动物仍可感染另一型口蹄疫病毒而发病，我国主要有O型和A型口蹄疫病毒流行。市场上常见有口蹄疫O型和A型的双价疫苗在销售和使用。其中，口蹄疫疫苗中常见的A型毒株包括Re-A/WH/09、AKT58、AKTIII和AF72多种毒株，不同的毒株的免疫原性和反应原性存在差异。疫苗接种是特异性预防FMDV的可靠和有效手段，对疫苗抗原含量的准确测量是保障疫苗安全有效的前提。口蹄疫疫苗生产企业目前常采用蔗糖密度梯度离心法测量口蹄疫病毒的蛋白含量，蔗糖密度梯度离心法根据分子大小、沉降系数将不同的物质分开，而口蹄疫病毒的大小基本一致，因此无法对多价疫苗中的某种毒株进行单独定量，沉降系数类似的杂质也难以与口蹄疫病毒区分。且蔗糖密度梯度离心法操作复杂，时间久，难以实现快速检测的目的。因此疫苗生产过程中，有快速检测的需求。对怀疑口蹄疫感染的动物常常现场采样然后送至专业实验室进行PCR检测。PCR方法需时长；并且成本高，对人员、环境和设备要求高，难以实现现场快速检测。众所周知，口蹄疫是一种感染急、传播速度快的疾病，因此如能进行现场快速检测显得非常有必要。另外病料组织的运输还可能导致潜在的生物传播风险。CN105950563A公开了一种杂交瘤细胞株7E3及其分泌的抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体与应用，其具体涉及的单克隆抗体7E3特异性较好，但是只能够检测毒株Re-A/WH/09，而不能检测毒株AKT58、AKTIII和AF72，因此检测谱较窄。CN107541500A公开了一种A型口蹄疫病毒单克隆抗体及其应用，具体提及一种单克隆抗体2A2，是口蹄疫A型的特异性单克隆抗体，但其未提示适用于哪种A型病毒毒株(例如Re-A/WH/09、AKT58、AKTIII或AF72等)，因此该单抗的检测谱不明确。且实施例显示采用ELISA方法检测病毒抗原时，该方法需要专门的仪器(酶标仪)和一定专业水平的实验人员进行操作，要求较高，时间需要2小时，同样不能满足现场快速检测的需求。口蹄疫疫苗免疫后评估抗体效价的水平有助于疫病的预防和控制。现在市场上最常用的是中国农业科学院兰州兽医研究所研制的系列口蹄疫抗体液相阻断ELISA试剂盒，该方法是OIE(国际兽疫局)推荐的方法，采用了两种多抗和灭活全病毒检测血清抗体水平，操作复杂，需要3-4个小时才可以完成检测。另外一种常用试剂盒为固相竞争ELISA试剂盒，待测样品中的抗体与酶标抗体竞争结合包被抗原。韩国进口固相竞争ELISA试剂盒采用包被重组抗原配合酶标单抗检测血清抗体；一些国产固相竞争ELISA试剂盒包被全病毒抗原配合多抗或单抗检测血清抗体，例如CN107541500A公开了采用全病毒配合单抗固相竞争法原理检测血清抗体。液相阻断和固相竞争都是竞争法的一种表现形式，这些竞争法产品在抗原或抗体层面存在不同程度的缺陷，①全病毒抗原难以获得高纯度的蛋白，现有工艺水平的蛋白纯度一般在10％之下，其中90％以上是杂蛋白比如细胞碎片蛋白、培养基蛋白等，这些杂质可能都会干扰检测，影响检测的特异性和灵敏度；②基因重组抗原与全病毒相比位点较少，可能存在漏点。另外重组抗原在空间构象上、翻译后的蛋白修饰上与天然全病毒的蛋白存在差异，因此也可能会引入非特异性因素导致检测结果的异常；③采用多抗进行检测可能由于多抗的“纯度”等原因导致检测结果的异常，此处“纯度”指的是制备多抗时所采用的抗原因其纯度不足而产生较多的非目标抗体的干扰。且多抗批次变异大，不利于大批量生产。综上所述，如以高纯度的全病毒抗原配合单克隆抗体检测血清抗体，则可能获得特异性好、灵敏度高的结果，但目前难以实现。间接法是临床常用的一种免疫检测方法，常常采用包被抗原配合酶标二抗来检测待测样品中的抗体。间接法试剂因其所用的抗原和二抗常常过量，所以容易放大生产且稳定性好。竞争法为了获得理想的效果，一定要控制抗原和抗体的用量，过量会导致灵敏度低；用量不足会导致特异性变差。间接ELISA方法也面临一个高纯度全病毒抗原的问题，如抗原纯度不好，则检测结果的特异性变差。常规液相色谱法(比如分子筛、离子交换、亲和纯化等)虽然可以对全病毒进行纯化，但操作复杂、需要专门的仪器(高效液相色谱仪等)和试剂(各种纯化柱)，且在纯化过程中易导致口蹄疫全病毒的裂解。如能采取简单的方法获得高纯度的全病毒抗原，采用稳定性更好的间接ELISA方法，则会获得一种灵敏度和特异性均佳的口蹄疫全病毒抗体检测方法。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本专利技术的一个方面提供一株杂交瘤细胞株6B1，其保藏编号为：CGMCCNo.17500；保藏日期为：2019年04月24日；保藏地址为：中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，是以口蹄疫A型病毒(AF72)抗原为免疫原免疫动物获得的分泌抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本专利技术另一方面提供一种由上述杂交瘤细胞株6B1CGMCCNo.17500分泌的抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体6B1anti。上述单克隆抗体6B1anti具有与口蹄疫A型病毒的多种毒株反应的广谱性，其中所述口蹄疫A型病毒的多种毒株包括Re-A/WH/09、AKT58、AKTIII、AF72毒株。本专利技术另一方面还提供一种检测口蹄疫A型病毒抗体的试剂盒，包括：上述抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体6B1anti和用辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗猪和/或小鼠抗牛和/或小鼠抗羊的酶标抗体工作液。上述试剂盒还包括酶标板，所述酶标板为用所述单克隆抗体6B1anti包被并进一步与灭活口蹄疫A型全病毒反应后的酶标板，其中所述灭活口蹄疫A型全病毒包括毒株Re-A/WH/09、AKT58、AKTIII和AF72。上述试剂盒在检测用疫苗免疫后样本中抗口蹄疫A型病毒抗体水平中的应用也属于本专利技术的保护内容，包括以下步骤：S1：向酶标板加样本反应，洗板；S2：加酶标记抗体工作液反应，洗板；S3：显色；S4：终止反应；和S5：测定OD450值。同步进行阳性质控的检测，其中阳性质控为口蹄疫A型抗体阳性的血清。待测样品结果判断：计算S/P值(平均抗体效价)即样本OD450/阳性质控OD450均值，若≥0.4，则判为阳性，阳性结果表示样本中检测到抗口蹄疫A型病毒抗体；否则为阴性，阴性结果表示样本中未检测到抗口蹄疫A型病毒抗体。通过对疫苗免疫后样本(例如血清)中抗口蹄疫A型病毒抗体水平的检测可用于评价疫苗质量，其中检测得到的样本OD450值越大，即S/P值越大，表明经口蹄疫A型本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.杂交瘤细胞株6B1，其保藏编号为：CGMCC No.17500；保藏日期为：2019年04月24日；保藏地址为：中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，是以口蹄疫A型病毒(AF72)抗原为免疫原免疫动物获得的分泌抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

【技术特征摘要】
1.杂交瘤细胞株6B1，其保藏编号为：CGMCCNo.17500；保藏日期为：2019年04月24日；保藏地址为：中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，是以口蹄疫A型病毒(AF72)抗原为免疫原免疫动物获得的分泌抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株6B1CGMCCNo.17500分泌的抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体6B1anti。3.根据权利要求2所述的单克隆抗体6B1anti，其特征在于，所述单克隆抗体6B1anti具有与口蹄疫A型病毒的多种毒株反应的广谱性，其中所述口蹄疫A型病毒的多种毒株包括Re-A/WH/09、AKT58、AKTIII、AF72毒株。4.一种检测口蹄疫A型病毒抗体的试剂盒，其特征在于，包括：权利要求2或3所述的抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体6B1anti和用辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗猪和/或小鼠抗牛和/或小鼠抗羊的酶标抗体工作液。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶标板，所述酶标板为用所述单克隆抗体6B1anti包被并进一步与灭活口蹄疫A型全病毒反应后的酶标板，其中所述灭活口蹄疫A型全病毒包括毒株Re-A/WH/09、AKT58、AKTIII和AF72。6.权利要求5所述的试剂盒在检测用疫苗免疫后样本中抗口蹄疫A型病毒抗体水平中的应用，其特征在于，包括以下步骤：S1：...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑金来，吴园园，郝金宝，李卫丽，卢小雨，张卉，周博，李丽燕，
申请(专利权)人：北京标驰泽惠生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11