一种靶向性抗肿瘤T细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种靶向性抗肿瘤T细胞，包括靶向EGFRvIII的嵌合抗原受体CAR‑EGFRvIII和/或靶向HER2的嵌合抗原受体CAR‑HER2，其中，所述CAR‑EGFRvIII包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向EGFRvIII的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR‑HER2包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向HER2的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列。该靶向性抗肿瘤T细胞可以精准高效地杀伤表面EGFRvIII和/或HER2阳性抗原的肿瘤细胞，有效克服肿瘤细胞的免疫逃逸。本发明专利技术还提供了该靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法和应用。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向性抗肿瘤T细胞及其制备方法和应用
本专利技术涉及医学生物领域，特别涉及一种靶向性抗肿瘤T细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
神经胶质瘤简称胶质瘤，是中枢神经系统(centralnervoussystem，CNS)最常见的恶性肿瘤，起源于神经胶质细胞。胶质瘤是一种侵袭性强、复发率高的肿瘤，由于其浸润性生长，手术治疗很难全部切除肿瘤细胞，即使辅于放疗、化疗等，仍然难免复发。嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy，CAR-T)技术是现有科技中唯一有可能彻底清除癌细胞的方法，其治疗肿瘤具有特异性强、几乎无毒副作用的巨大优势弥补了传统疗法的弊端，在国内外已经用于临床治疗恶性肿瘤，并在白血病、骨髓瘤、淋巴瘤等血液系统肿瘤中取得了卓越的临床疗效。但是，CAR-T技术目前的应用还局限于血液瘤，在胶质瘤等肿瘤细胞的应用还未有相关研究；同时，CAR-T技术应用过程中时常出现肿瘤细胞上靶位肿瘤抗原的丢失、细胞内吞、变异，导致CAR-T细胞无法识别和激活。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种靶向性抗肿瘤T细胞及其制备方法和应用，本专利技术提供的靶向性抗肿瘤T细胞，既可以有效识别表面表达有EGFRvIII(表皮生长因子受体III型突变体)抗原蛋白的肿瘤细胞又可以有效识别表面表达有HER2(人上皮生长因子受体2)抗原蛋白的肿瘤细胞，并激活T细胞的免疫作用对EGFRvIII和HER2阳性肿瘤细胞进行杀伤，具有持久细胞活力和杀伤力，有效克服所靶向的肿瘤细胞表面EGFRvIII抗原蛋白或HER2抗原蛋白出现丢失、细胞内吞、变异等所引起的免疫逃逸；此外，所述靶向性抗肿瘤T细胞对正常细胞不会造成损伤。第一方面，本专利技术提供了一种靶向性抗肿瘤T细胞，包括靶向EGFRvIII的嵌合抗原受体CAR-EGFRvIII和/或靶向HER2的嵌合抗原受体CAR-HER2，其中，所述CAR-EGFRvIII包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向EGFRvIII的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-HER2包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向HER2的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；其中，所述靶向EGFRvIII的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，所述靶向HER2的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。本专利技术所述靶向性抗肿瘤T细胞的特异性靶点包括表皮生长因子受体III型突变体(epidermalgrowthfactorreceptorvariantIII，EGFRvIII)和人上皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2，HER2)。其中，所述EGFRvIII是表皮生长因子受体(EGFR)的最常见突变体，在脑胶质瘤、乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤中表达率很高，很多研究表明，EGFRvIII一般在肿瘤细胞中出现，在正常人细胞中几乎不表达。HER2同样是在胶质瘤、乳腺癌等多种肿瘤细胞中高表达，且对肿瘤的发生和转移发挥着重要作用的表皮生长因子受体家族分子；研究表明，HER2在正常人的中枢神经系统中不表达，但是在脑胶质瘤中，胶质瘤细胞表面的HER2过表达与其恶性表型密切相关，因此，它可以成为人胶质瘤治疗的特异性靶点。其中，所述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向CAR-EGFRvIII的单链抗体或所述靶向HER2的单链抗体的氨基酸序列的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，所述胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区的氨基酸序列的氨基端相连。可选地，所述靶向EGFRvIII的单链抗体的编码基因包括如SEQIDNO：3所示的核苷酸序列，所述靶向HER2的单链抗体的编码基因包括如SEQIDNO：4所示的核苷酸序列。本专利技术所述靶向EGFRvIII的单链抗体保留有对EGFRvIII抗原的亲和活性，能够高效识别表面表达有EGFRvIII抗原的肿瘤细胞。所述靶向HER2的单链抗体同样保留有对HER2抗原的亲和活性，能够高效识别表面具有HER2阳性抗原的肿瘤细胞。可选地，所述靶向EGFRvIII的单链抗体的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQIDNO:3具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQIDNO:1。所述靶向HER2的单链抗体的氨基酸序列的编码基因同样应该考虑简并碱基。在本专利技术中，所述CAR-EGFRvIII中的所述胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列与所述CAR-HER2中的所述胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区对应的氨基酸序列可以相同，也可以部分不同。本专利技术中，所述胞外铰链区用于促进所述靶向EGFRvIII或HER2的单链抗体与肿瘤上的EGFRvIII或HER2结合。可选地，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、CD5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。进一步可选地，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区。可选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列包括如SEQIDNO：9所示的氨基酸序列。可选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列的编码基因包括如SEQIDNO：10所示的核苷酸序列。可选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列的编码基因包括如SEQIDNO：11所示的核苷酸序列。可选地，CD8α铰链区的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQIDNO:9所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQIDNO:10所示的核苷酸序列或如SEQIDNO:11所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQIDNO:10或SEQIDNO:11具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQIDNO:9。本专利技术中，所述跨膜区用于固定所述嵌合抗原受体CAR-EGFRvIII或CAR-HER2。可选地，所述跨膜区包括CD3跨膜区、CD4跨膜区、CD8跨膜区、CD28跨膜区中的一种或多种的组合。进一步可选地，所述跨膜区包括CD8跨膜区。可选地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列包括如SEQIDNO：12所示的氨基酸序列。可选地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列的编码基因包括如SEQIDNO：13所示的核苷酸序列。可选地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列的编码基因包括如SEQIDNO：14所示的核苷酸序列。可选地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQIDNO:12所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQIDNO:13所示的核苷酸序列或如SEQIDNO:14所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQIDNO:13或SEQIDNO:14具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQIDNO:12。本专利技术中，所述胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路。可选地，所述胞内信号区包本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向性抗肿瘤T细胞，其特征在于，包括靶向EGFRvIII的嵌合抗原受体CAR‑EGFRvIII和/或靶向HER2的嵌合抗原受体CAR‑HER2，其中，所述CAR‑EGFRvIII包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向EGFRvIII的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR‑HER2包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向HER2的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；其中，所述靶向EGFRvIII的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述靶向HER2的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种靶向性抗肿瘤T细胞，其特征在于，包括靶向EGFRvIII的嵌合抗原受体CAR-EGFRvIII和/或靶向HER2的嵌合抗原受体CAR-HER2，其中，所述CAR-EGFRvIII包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向EGFRvIII的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-HER2包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向HER2的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；其中，所述靶向EGFRvIII的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，所述靶向HER2的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的靶向性抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述靶向EGFRvIII的单链抗体的编码基因包括如SEQIDNO：3所示的核苷酸序列，所述靶向HER2的单链抗体的编码基因包括如SEQIDNO：4所示的核苷酸序列。3.如权利要求1所述的靶向性抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述CAR-EGFRvIII的氨基酸序列包括如SEQIDNO：5所示的氨基酸序列，所述CAR-HER2的氨基酸序列包括如SEQIDNO：6所示的氨基酸序列。4.一种重组病毒载体，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的靶向性抗肿瘤T细胞中所述CAR-EGFRvIII和/或CAR-HER2的编码基因。5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求4所述的重组病毒载体。6.一种靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法，其特征在于，包括：(1)分别提供靶向EGFRvIII的嵌合抗原受体CAR-EGFRvIII的编码基因和靶向HER2的嵌合抗原受体CAR-HER2的编码基因；所述CAR-EGFRvIII的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向EGFRvIII的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；所述CAR-HER2的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向HER2的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；其中，所述靶向E...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宏玲，钟春颖，
申请(专利权)人：深圳宾德生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44