一种靶向性T淋巴细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种靶向性T淋巴细胞，包括靶向DR5的嵌合抗原受体CAR‑DR5和/或靶向c‑Met的嵌合抗原受体CAR‑c‑Met，CAR‑DR5可以专一性的靶向DR5，CAR‑c‑Met可以专一性的靶向c‑Met，从而促进T细胞在患者体内的扩增，高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，并且能够有效的抑制肿瘤细胞逃逸的发生，更好的维持细胞的活力和杀伤力。本发明专利技术还提供了该靶向性T淋巴细胞的制备方法和应用。

A Targeted T Lymphocyte and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种靶向性T淋巴细胞及其制备方法和应用
本专利技术涉及医学生物领域，特别涉及一种靶向性T淋巴细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是世界范围内排位第五位的最常见的恶性肿瘤。在我国，每年由于肝癌死亡的人数超过十万。目前，HCC的治疗方法包括非特异性免疫治疗、主动免疫治疗、过继性细胞免疫治疗等。其中，过继性细胞免疫治疗被认为是现有科技中有可能彻底清除癌细胞的方法。嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)作为当前最新的免疫细胞技术之一，因其能够表达特异性受体靶向识别特异性的细胞如肿瘤细胞，受到广泛的关注和研究。CAR-T的肿瘤识别蛋白为人工设计的跨膜信号蛋白，CAR-T免疫细胞是应用基因修饰病人自体的T细胞，利用抗原抗体结合的机制，可以不依赖于主要组织相容性复合体的方式活化淋巴细胞，从而杀伤肿瘤。CAR-T免疫细胞因抗肿瘤的特异性和靶向性增强，同时杀伤活性和持久性也增强，因此具有非常广阔的应用前景。肝脏是机体的免疫器官，拥有独特的免疫系统，具备免疫监视功能，能将偶然出现的肿瘤细胞作为异物加以清除。但HCC通过抗原的表达异常，代谢产物与细胞因子的异常分泌和肝癌细胞所处的免疫微环境发生改变等途径来逃避机体免疫系统的识别和攻击，发生肿瘤免疫逃逸。因此，亟需一种制备工艺简单、特异性强且能够减少肿瘤免疫逃逸发生的方法用于HCC治疗过程中。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种靶向性T淋巴细胞，包括靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5和/或靶向c-Met的嵌合抗原受体CAR-c-Met，CAR-DR5可以专一性的靶向DR5，CAR-c-Met可以专一性的靶向c-Met，从而促进T细胞在患者体内的扩增，高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，并且能够有效的抑制肿瘤细胞逃逸的发生，更好的维持细胞的活力和杀伤力。本专利技术还提供了该靶向性T淋巴细胞的制备方法和应用。第一方面，本专利技术提供了一种靶向性T淋巴细胞，包括靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5和/或靶向c-Met的嵌合抗原受体CAR-c-Met，其中，所述CAR-DR5包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向DR5的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-c-Met包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向c-Met的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；其中，所述靶向DR5的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，所述靶向c-Met的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。在本专利技术中，死亡受体5(deathreceptor5；DR5)属于肿瘤坏死因子受体超家族成员(TNFRSF10B)，其胞质区含死亡结构域。DR5在肝癌等多种实体瘤细胞中广泛表达，而在普通细胞中表达很微弱的细胞表面抗原。当它与相关配体结合时，能选择性地杀伤多种肿瘤细胞而对正常细胞没有毒性，是肿瘤治疗过程中重要的靶点。受体酪氨酸激酶c-Met又称为肝细胞生长因子(hypatocytegrowthfactor，HGF)受体，是受体酪氨酸激酶家族中一类独特的亚族。c-Met的高表达常见于人肝脏等多种实体肿瘤，c-Met与HGF结合产生信号通路，过度激活将会引起下游信号通路的活化，从而诱导癌症的发生。因此，c-Met是肿瘤特别是肝癌治疗过程中的重要靶点。其中，所述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向DR5的单链抗体的氨基酸序列(或所述靶向c-Met的单链抗体的氨基酸序列)的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，所述胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区的氨基酸序列的氨基端相连。可选的，所述靶向DR5的单链抗体的编码基因包括如SEQIDNO：3所示的核苷酸序列，所述靶向c-Met的单链抗体的编码基因包括如SEQIDNO：4所示的核苷酸序列。在本专利技术中，所述靶向DR5的单链抗体保留有对DR5抗原的亲和活性，能够高效识别表面表达有DR5抗原的肿瘤细胞。所述靶向c-Met的单链抗体同样保留有对c-Met抗原的亲和活性，能够高效识别表面表达有c-Met抗原的肿瘤细胞。在本专利技术中，所述CAR-DR5中的所述胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列与所述CAR-c-Met中的所述胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区对应的氨基酸序列可以相同，也可以不同。在本专利技术中，所述CAR-DR5中的胞外铰链区用于促进所述靶向DR5的单链抗体与肿瘤上的DR5结合；所述CAR-c-Met中的胞外铰链用于促进所述靶向c-Met的单链抗体与肿瘤上的c-Met结合。可选的，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、CD5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。进一步可选的，所述胞外铰链区为CD8α铰链区。可选的，所述CD8α铰链区的氨基酸序列包括如SEQIDNO：9所示的氨基酸序列。可选的，所述CD8α铰链区的编码基因包括如SEQIDNO：10所示的核苷酸序列。可选的，所述CD8α铰链区的编码基因包括如SEQIDNO：11所示的核苷酸序列。可选的，所述CD8α铰链区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQIDNO:9所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQIDNO:10或如SEQIDNO：11所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQIDNO:10或SEQIDNO：11具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQIDNO:9。在本专利技术中，所述CAR-DR5中的跨膜区用于固定所述靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5；所述CAR-c-Met中的跨膜区用于固定所述靶向c-Met的嵌合抗原受体CAR-c-Met。可选的，所述跨膜区包括CD3跨膜区、CD4跨膜区、CD8跨膜区、CD28跨膜区中的一种或多种的组合。进一步可选的，所述跨膜区为CD8跨膜区。可选的，所述CD8跨膜区的氨基酸序列包括如SEQIDNO：12所示的氨基酸序列。可选的，所述CD8跨膜区的编码基因包括如SEQIDNO：13所示的核苷酸序列。可选的，所述CD8跨膜区的编码基因包括如SEQIDNO：14所示的核苷酸序列。可选的，所述CD8跨膜区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQIDNO:12所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQIDNO:13或如SEQIDNO：14所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQIDNO:13或SEQIDNO：14具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQIDNO:12。在本专利技术中，所述CAR-DR5中的胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路；所述CAR-c-Met中的胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路。可选的，所述胞内信号区包括4-1BB信号区、CD3ζ信号区、ICOS信号区、CD27信号区、OX40信号区、CD28信号区、IL1R1信号区、CD70信号区、TNFRSF19L信号区中的一种或多种的组合。可选的，所述胞内信号区为4-1BB信号区本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向性T淋巴细胞，其特征在于，包括靶向DR5的嵌合抗原受体CAR‑DR5和/或靶向c‑Met的嵌合抗原受体CAR‑c‑Met，其中，所述CAR‑DR5包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向DR5的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR‑c‑Met包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向c‑Met的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；其中，所述靶向DR5的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述靶向c‑Met的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种靶向性T淋巴细胞，其特征在于，包括靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5和/或靶向c-Met的嵌合抗原受体CAR-c-Met，其中，所述CAR-DR5包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向DR5的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-c-Met包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向c-Met的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；其中，所述靶向DR5的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，所述靶向c-Met的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的靶向性T淋巴细胞，其特征在于，所述靶向DR5的单链抗体的编码基因包括如SEQIDNO：3所示的核苷酸序列，所述靶向c-Met的单链抗体的编码基因包括如SEQIDNO：4所示的核苷酸序列。3.如权利要求1所述的靶向性T淋巴细胞，其特征在于，所述CAR-DR5的氨基酸序列包括如SEQIDNO：5所示的氨基酸序列，所述CAR-c-Met的氨基酸序列包括如SEQIDNO：6所示的氨基酸序列。4.一种重组病毒载体，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的靶向性T淋巴细胞中所述CAR-DR5和/或CAR-c-Met的编码基因。5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求4所述的重组病毒载体。6.一种靶向性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包括：(1)分别提供靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5的编码基因和靶向c-Met的嵌合抗原受体CAR-c-Met的编码基因；所述CAR-DR5的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向DR5的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；所述CAR-c-Met的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向c-Met的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；其中，所述靶向DR5的单链抗体的编码基因包括如SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宏玲，钟春颖，
申请(专利权)人：深圳宾德生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44