无色素低分子量威兰胶生产菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了无色素低分子量威兰胶生产菌株，以Sphingomonas sp.HT‑1(保藏号CCTCC NO：M2012062)为出发菌株，分别构建了色素缺陷型并解除包囊结构的鞘氨醇单胞菌基因工程菌WG‑1，色素和降解酶基因缺陷型的鞘氨醇单胞菌基因工程菌WG‑2，以及色素和降解酶基因缺陷型并解除包囊结构的鞘氨醇单胞菌基因工程菌WG‑3。本发明专利技术中鞘氨醇单胞菌WG‑2菌株威兰胶产量较出发菌株提高10％～30％，达到35～45g/L，且分子量无明显变化(Mn：10000～20000kDa)；本发明专利技术中鞘氨醇单胞菌WG‑1、WG‑3菌株发酵生产低分子量威兰胶(Mn：500～1000kDa)，且解除包囊结构的WG‑3产量较WG‑1菌株提高了20～30％，达到20～25g/L。本发明专利技术所构建菌株，能够获得不同分子量范围的威兰胶产品，且显著提升了威兰胶的发酵水平。

A Pigment-free Low Molecular Weight Velan Gum Producing Strain and Its Construction Method and Application

【技术实现步骤摘要】
无色素低分子量威兰胶生产菌株及其构建方法与应用
本专利技术涉及微生物基因工程菌领域，具体涉及无色素低分子量威兰胶生产菌株及其构建方法与应用。
技术介绍
微生物多糖是一类环保绿色的可通过生物发酵制得的产物，对人类生活和工农业生产应用具有重要的作用。微生物多糖能在科学研究和工业化生产上取得成功主要基于以下几点：(1)多糖的性质及其具有的应用价值；(2)可以通过选合适的菌种在受控条件下进行生产；(3)提取工艺的可行性；(4)不含毒素；(5)不同微生物能够合成很多非常特殊的离子型和中性多糖，这些微生物多糖在工业生产与生活的许多领域具有广泛的应用价值，可以替代很多价格不菲的化学合成品，具有良好的环境友好性和商业开发潜力。目前全世界微生物多糖需求量约为15～20万吨/年，年产值可达150-200亿美元，产量和年增长量均在10％以上，而一些新型多糖年增长量在30％以上。上世纪80年代继黄原胶之后，美国Kelco公司陆续发现了一组新型的微生物多糖即由鞘氨醇单胞菌产生的结冷胶类多糖，引起了科学界和工业界的浓厚兴趣。该类多糖主链结构均为葡萄糖、葡萄糖醛酸、甘露糖或鼠李糖，它们具有许多优良而独特的理化特性，可以作为增稠剂、悬浮剂、稳定剂等广泛用于石油、混凝土、涂料行业，也可用于油墨、食品、纺织印染、农药、化妆品、医药等行业。目前，微生物多糖中除了黄原胶生产规模较大，结冷胶、威兰胶、鼠李糖胶生产规模均不大，而国内直到近几年才开始威兰胶生产，但仍存在许多问题亟待解决，如威兰胶生物合成伴随着类胡萝卜素的产生，后期分离过程中大量乙醇的使用进一步提高生产成本，造成下游污染；威兰胶会附着在细胞表面上，形成包囊状结构，降低传质效率，阻碍菌胶分离等，同时研究者对不同分子量威兰胶生物合成机制及应用等方面的研究较少。因此构建解除包囊结构的色度缺陷型生产菌株不仅利于提高工业生产效率，降低成本，更能获得多元分子量的威兰胶产品，有助于拓宽威兰胶的下游应用领域。
技术实现思路
专利技术目的：为了解决现有威兰胶生产过程中乙醇用量大及菌胶分离困难的问题，本专利技术提供了一种解除包囊结构且色素缺陷的鞘氨醇单胞菌基因工程菌作为无色素低分子量威兰胶的生产菌株。本专利技术进一步的目的是提供上述解除包囊结构且色素缺陷的鞘氨醇单胞菌基因工程菌的构建方法。本专利技术更进一步的目的是提供鞘氨醇单胞菌基因工程菌在制备生产无色素低分子量威兰胶中的应用。目前为止，鞘氨醇单胞菌中类胡萝卜素合成途径的研究较少。技术方案：为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种鞘氨醇单胞菌基因工程菌，所述鞘氨醇单胞菌基因工程菌中八氢番茄红素合成酶基因crtB失活；或者，八氢番茄红素合成酶基因crtB和分选酶基因srtW同时失活；或者，八氢番茄红素合成酶基因crtB和降解酶基因gelR同时失活；或者，八氢番茄红素合成酶基因crtB、分选酶基因srtW和降解酶基因gelR同时失活。所述八氢番茄红素合成酶基因crtB是细菌体内类胡萝卜素合成过程中，催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)缩合形成第一个类胡萝卜素——八氢番茄红素的关键酶。所述分选酶基因srtW是存在于革兰氏阴性菌必须的膜蛋白组分，与胞外多糖以及其他胞外聚合体的生物合成有很大相关性，最早发现于金黄色葡萄球菌中，催化和引导细胞表面蛋白共价结合到细胞壁肽聚糖上。所述降解酶基因gelR是类似于编码细菌和真菌多糖裂解酶的蛋白质。所述八氢番茄红素合成酶基因crtB失活是指八氢番茄红素合成酶基因crtB丧失编码八氢番茄红素合成酶的能力，或者编码的八氢番茄红素合成酶没有活性；所述分选酶基因srtW失活是指分选酶基因srtW丧失编码分选酶的能力，或者编码的分选酶没有活性；所述降解酶基因gelR失活是指降解酶基因gelR丧失编码降解酶的能力，或者编码的降解酶没有活性。其中，所述的鞘氨醇单胞菌基因工程菌的出发菌为Sphingomonassp.HT-1，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCNo：M2012062，该菌株的详细信息已经在申请号为201210086289.4的中国专利中详细公开。其中，所述八氢番茄红素合成酶基因crtB失活是指八氢番茄红素合成酶基因crtB被完全敲除；所述分选酶基因srtW失活是指分选酶基因srtW被完全敲除；降解酶基因gelR失活是指分降解酶基因gelR被完全敲除。其中，所述八氢番茄红素合成酶基因crtB的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述选酶基因srtW的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述降解酶基因gelR的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。上述无色素低分子量威兰胶生产菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)分别构建八氢番茄红素合成酶基因crtB基因敲除片段、分选酶基因srtW基因敲除片段、降解酶基因gelR基因敲除片段，将上述三种基因敲除片段分别导入敲除质粒中，得到八氢番茄红素合成酶基因crtB基因敲除质粒、分选酶基因srtW基因敲除质粒、降解酶基因gelR基因敲除质粒；(2)将八氢番茄红素合成酶基因crtB基因敲除质粒转化出发菌，经筛选得到八氢番茄红素合成酶基因crtB失活的基因工程菌；将分选酶基因srtW基因敲除质粒转化出发菌，经筛选得到分选酶基因srtW失活的基因工程菌；将降解酶基因gelR基因除质粒转化出发菌，经筛选得到降解酶基因gelR失活的基因工程菌。通过两步同源重组构建八氢番茄红素合成酶基因(crtB)与分选酶基因(srtW)的敲除菌株WG-1，构建八氢番茄红素合成酶基因(crtB)与降解酶基因(gelR)的敲除菌株WG-2，构建八氢番茄红素合成酶基因(crtB)与分选酶基因(srtW)与降解酶基因(gelR)的敲除菌株WG-3。以敲除编码八氢番茄红素合成酶crtB基因为例，具体的敲除方法如下：(1a)以S.sp.HT-1基因组为模板，PCR扩增crtB上下游同源片段，以自杀型载体pJQ200SK为出发质粒，构建crtB敲除载体pJQ-△crtB；(2a)将pJQ-△crtB转化至大肠杆菌S17-1感受态细胞中，涂布于含50μg/mL庆大霉素的LB固体培养基上。倒置于37℃培养箱中过夜培养。挑取克隆子进行验证，所得阳性菌株命名为E.coliS17-pJQ-△crtB(3a)同源重组获得crtB基因敲除重组子：同源重组分两步进行：第一次同源重组：利用接合转移的手段，在辅助菌E.coliHB101(pRK2013)的作用下，将携带crtB上下游基因片段的敲除质粒pJQ-△crtB转化至S.sp.HT-1中，挑取单交换克隆子扩大培养；第二次同源重组：利用pJQ200SK中sacB基因做反向筛选，获得双交换菌株。最终构建得到色素缺陷型鞘氨醇单胞菌基因工程菌S.sp.HT-1(△crtB)。在敲除多个基因时，可以将之前已经敲除一个基因或两个基因的菌株作为出发菌。步骤(1)中，所述八氢番茄红素合成酶基因crtB基因敲除片段的构建方法如下：以Sphingomonassp.HT-1基因组为模板，SEQIDNO.14和SEQIDNO.15、SEQIDNO.16和SEQIDNO.17为引物分别扩增八氢番茄红素合成酶基因crtB基因上游同源臂crtB-L和下游同源臂crtB-R；以上游同源臂crtB-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.无色素低分子量威兰胶生产菌株，其特征在于，所述菌株中八氢番茄红素合成酶基因crtB失活；或者，八氢番茄红素合成酶基因crtB和分选酶基因srtW同时失活；或者，八氢番茄红素合成酶基因crtB和降解酶基因gelR同时失活；或者，八氢番茄红素合成酶基因crtB、分选酶基因srtW和降解酶基因gelR同时失活。

【技术特征摘要】
1.无色素低分子量威兰胶生产菌株，其特征在于，所述菌株中八氢番茄红素合成酶基因crtB失活；或者，八氢番茄红素合成酶基因crtB和分选酶基因srtW同时失活；或者，八氢番茄红素合成酶基因crtB和降解酶基因gelR同时失活；或者，八氢番茄红素合成酶基因crtB、分选酶基因srtW和降解酶基因gelR同时失活。2.根据权利要求1所述的无色素低分子量威兰胶生产菌株，其特征在于，所述的鞘氨醇单胞菌基因工程菌的出发菌为Sphingomonassp.HT-1。3.根据权利要求1所述的无色素低分子量威兰胶生产菌株，其特征在于，所述八氢番茄红素合成酶基因crtB失活是指八氢番茄红素合成酶基因crtB被完全敲除，；所述分选酶基因srtW失活是指分选酶基因srtW被完全敲除；降解酶基因gelR失活是指降解酶基因gelR被完全敲除。4.根据权利要求1所述的无色素低分子量威兰胶生产菌株，其特征在于，所述八氢番茄红素合成酶基因crtB的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述选酶基因srtW的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述降解酶基因gelR的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。5.权利要求1所述的无色素低分子量威兰胶生产菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)分别构建八氢番茄红素合成酶基因crtB基因敲除片段、分选酶基因srtW基因敲除片段、降解酶基因gelR基因敲除片段，将上述三种基因敲除片段分别导入敲除质粒中，得到八氢番茄红素合成酶基因crtB基因敲除质粒、分选酶基因srtW基因敲除质粒、降解酶基因gelR基因敲除质粒；(2)将八氢番茄红素合成酶基因crtB基因敲除质粒转化出发菌，经筛选得到八氢番茄红素合成酶基因crtB失活的基因工程菌；将分选酶基因srtW基因敲除质粒转化出发菌，经筛选得到分选酶基因srtW失活的基因工程菌；将降解酶基因gelR基因除质粒转化出发菌，经筛选得到降解酶基因gelR失活的基因工程菌。6.根据权利要求5所述无色素低分子量威兰胶生产菌株的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述八氢番茄红素合成酶基因crtB基因敲除片段的构建方法如下：以Sphingomona...

【专利技术属性】
技术研发人员：李莎，赵明，徐虹，薛瑞，刘晓柳，冯小海，朱萍，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32