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干酪乳杆菌菌株及其应用制造技术

技术编号:21908245 阅读:79 留言:0更新日期:2019-08-21 10:44
本发明专利技术涉及干酪乳杆菌菌株LTL1361及其应用。LTL1361保藏编号是CCTCC M 2019018,可以以活体和/或非活体形式存在,其可以应用于食品、保健品、药品、食品补充剂、化妆品、饲料方面,也可以用于抗菌和消炎,特别是抑制大肠杆菌、金黄葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、福氏志贺氏菌及鼠伤寒沙门氏菌。LTL1361对胃肠道环境的耐受能力强,与肠道上皮细胞的黏附能力强,在人体肠道的定植能力强,安全性高,无脱羧酶活性,对常用的10类抗生素都敏感,具有优良的抑制有害菌的能力。

Lactobacillus casei strain and its application

【技术实现步骤摘要】
干酪乳杆菌菌株及其应用
本专利技术属于生物
;具体涉及干酪乳杆菌菌株及其应用。
技术介绍
乳酸杆菌已有很长的食用历史,它维护人体健康和调节免疫功能的作用已被广泛认可,属于公认的安全菌属,在适当条件培养下通常能产生良好的风味,有些菌株甚至能表现出绝佳的产酸能力以及优异的免疫调节功效,大幅提升产品价值。如干酪乳酸杆菌代田株是著名乳酸菌饮料养乐多中采用的一种乳酸杆菌。乳酸杆菌属的特定菌株已被发现能够定植于肠道粘膜,协助并维持人类和动物的健康,例如抗发炎活性和免疫调节活性。干酪乳杆菌作为益生菌的一种,能够耐受有机体的防御机制,包括口腔中的酶、胃酸和小肠的胆汁酸等。所以干酪乳杆菌进入人体后可以在肠道内大量存活,起到调节肠内菌群平衡、促进人体消化吸收等作用。同时,干酪乳杆菌还具有一定的降血压、降胆固醇的作用,能产生抗体免疫抗体,增强人体免疫力及预防癌症和抑制肿瘤生长等功能。干酪乳杆菌能够抑制和杀死食品中的许多腐败菌及致病菌,并且不影响食物性状,甚至能够改善食品特性。因此筛选性能更佳的干酪乳杆菌对于提升食品品质,提高食品价值有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一株干酪乳杆菌菌株。本专利技术的第二个目的是提供以上干酪乳杆菌菌株的应用。实现上述第一个专利技术目的的技术方案是:所述干酪乳杆菌菌株的保藏编号是CCTCCM2019018,其核苷酸包含SEQIDNO:1至SEQIDNO:51所示的特征序列。该干酪乳杆菌菌株可以以活体形式存在,也可以非活体形式存在。活体形式存在优选以冻干粉形式存在。实现上述第二个专利技术目的的技术方案是:所述干酪乳杆菌菌株在食品、保健品、药品、食品补充剂、化妆品、饲料方面的应用;也可以用于抗菌和消炎,特别是抑制大肠杆菌、金黄葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、福氏志贺氏菌及鼠伤寒沙门氏菌。本专利技术的干酪乳杆菌菌株LTL1361对胃肠道环境的耐受能力强,经过模拟胃肠道环境作用4h后,菌株存活率仍然很高;与肠道上皮细胞的黏附能力强,其在人结直肠癌细胞——Caco-2细胞上的粘附数比现有干酪乳杆菌明显要多,说明LTL1361菌株在人体肠道的定植能力强;而且LTL1361安全性高,无脱羧酶活性,对常用的10类抗生素都敏感,具有优良的抑制有害菌的能力。附图说明图1粪便样品稀释液在改良的MRS固体培养基上培养后的典型菌落图2有溶钙圈或浅蓝色的单菌落划线多代纯化结果图3LTL1361特异性引物PCR验证结果图4LTL1361核苷酸PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果图5LTL1361全基因组图谱图6LTL1361菌株生长曲线图7LTL1361体外粘附人结直肠癌细胞Caco-2图图8LTL1361体外粘附人结直肠癌细胞Caco-2实验结果图9LTL1361氨基酸脱羧酶活性检测,其中A为精氨酸,B为赖氨酸,C为酪氨酸,D为组氨酸生物材料保藏信息LTL1361,分类命名为干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei),已于2019年1月4日在位于湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山的中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为CCTCCM2019018。具体实施方式本专利技术具体实施方式中的试验结果数据皆以平均值±标准差(Means±SD)表示。统计分析使用单因子变异数分析[One-wayanalysisofvariance(One-wayANOVA)]。“+”表示90%菌株阳性;“-”表示90%菌株阴性;“d”表示11%~89%菌株阳性。本专利技术具体实施方式中,“NCBI”表示美国国家生物技术信息中心。“BLAST”是“BasicLocalAlignmentSearchTool”的缩写,一种生物信息分析软件名称。所有核苷酸的测序单位是生工生物工程(上海)股份有限公司,使用的测序仪器是Illumina公司的Hiseq-2500150PE测序平台。本专利技术实施例中所采用的实验方法,如果没有给出特殊说明,均为本领域常规方法;所用的实验材料,如果没有给出特殊说明,说明可从商业途径获得。实施例1菌种筛选与鉴定1.菌种筛选与鉴定收集广西巴马县2个月以内未服用任何抗生素或乳酸杆菌制剂,且居住地位置分散、年龄在100岁~128岁之间的健康老人粪便样品,冷冻保藏。粪便样品解冻后用无菌磷酸盐缓冲溶液溶解并稀释成梯度浓度,涂布在改良的MRS琼脂平板上,37℃培养。培养结果见图1。所述“改良的MRS固体培养基”是指MRS固体培养基中含碳酸钙(CaCO3)和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal),CaCO3的质量百分比浓度是0.8%,X-gal的浓度是每200mL培养基含2%X-gal200μl。从图1可以观察到形成的菌落形态为圆形、乳白色、在改良的MRS琼脂平板上形成钙溶圈、不透明、表面光滑、边缘圆整、凸起、直径小于1.5mm。挑取有溶钙圈或浅蓝色的单菌落划线多代纯化。纯化结果见图2。纯化得到的菌株编号为LTL1361,用40%甘油于-20℃和-80℃下分别保存,备用。革兰氏染色后观察到细胞形态为杆菌、革兰氏阳性菌,或丛生、或对生。根据《伯杰士细菌学手册》乳杆菌属部分菌落形态及细胞形态特征,LTL1361符合乳杆菌形态学鉴定特征,为疑似乳酸杆菌。对LTL1361进行过氧化氢酶试验、葡萄糖产酸产气试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验、石蕊牛乳试验、温度耐受试验、pH试验(结果见表1),以及糖类发酵试验(结果见表2)。根据《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》,由表1、表2的实验结果可初步鉴定LTL1361为干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)。表1LTL1361生理生化实验鉴定结果表2LTL1361糖发酵实验结果2.特异性引物PCR验证LTL1361为了鉴定LTL1361,进一步对LTL1361进行特异性引物聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)验证。设计的特异性引物如下:F:5’-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3’R:5’-ATTTCACCGCTACACATG-3’PCR扩增后,PCR产物琼脂糖凝胶电泳,Marker采用100bpDNAmarker。电泳结果见图3。干酪乳杆菌特异性引物PCR后,片段长度为344bp,图3在相应处出现了荧光条带,且无明显拖尾现象,说明PCR成功,从特定引物角度确认了上述生理生化和糖发酵实验鉴定结果。3.16SrDNA序列鉴定再对LTL1361的16SrDNA核甘酸序列进行鉴定。提取LTL1361基因组DNA,将提取的LTL1361基因组DNA作为模板进行聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)。通用引物如下:27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′1492R:5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图4。图4显示在约1500bp处出现了荧光条带,无明显拖尾现象,说明PCR扩增成功,满足16SrDNA序列测定需要。序列测定结果与美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,简称NCBI)数据库进行BLAST比对,结果表明LTL1361与干酪乳杆菌标准菌株ATCC334相似度达100%。综合LTL1361形态本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株干酪乳杆菌菌株,其特征是:保藏编号是CCTCC M 2019018。

【技术特征摘要】
1.一株干酪乳杆菌菌株,其特征是:保藏编号是CCTCCM2019018。2.权利要求1所述干酪乳杆菌菌株,其特征是:包含SEQIDNO:1至SEQIDNO:51所示的特征序列。3.权利要求1所述干酪乳杆菌菌株,其特征是:以活体形式存在。4.权利要求3所述干酪乳杆菌菌株,其特征是:以冻干粉形式存在。5.权利要求1所述干酪乳杆...

【专利技术属性】
技术研发人员:李全阳梅丽华
申请(专利权)人:广西大学
类型:发明
国别省市:广西,45

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