一种灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸的同步提取纯化方法技术

本发明专利技术提供了一种灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸的同步提取纯化方法，属于天然产物提取技术领域。本发明专利技术的方法是以灵芝子实体为起始原料，通过使用碱液低温超声提取，同时使用抗氧剂保护多糖及易氧化成分，提高灵芝多糖及活性成分的提取率，而且采用陶瓷膜微滤技术，大大增加了浓缩效率及粗分效果，同时使用相匹配的离子交换树脂进行纯化、醇沉及超滤技术，使灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸含量都得到了提高，本发明专利技术方法从灵芝子实体中提取纯化得到灵芝多糖含量在90％以上、灵芝三萜酸含量在92％以上、氨基酸含量在60％以上，更适合于工业生产应用，且简化了提取纯化步骤，降低了成本。

A Simultaneous Extraction and Purification Method of Ganoderma Lucidum Polysaccharide, Ganoderma Triterpene Acid and Amino Acids

【技术实现步骤摘要】
一种灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸的同步提取纯化方法
本专利技术属于天然产物的提取分离方法，具体涉及灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸活性成分的同步提取分离纯化方法。
技术介绍
灵芝(Ganodermalucidum(LeyssexFr.)Krast.)属于担子菌纲、多孔菌科、灵芝属真菌。传统中医认为，灵芝味甘、性温、无毒，具有滋补强身、扶正固本之功效，作为我国中草药珍品，素有“仙草”之誉，具有独特、优异的生理效能。东汉时期的《神农本草经》、明代著名医药学家李时珍的《本草纲目》，即对灵芝的功效有详细的极为肯定的记载。现代研究表明，灵芝药理成分非常丰富，其中有效成份达10大类，包括灵芝多糖、灵芝多肽、三萜类、氨基酸、甾类、甘露醇、香豆精苷、生物碱、有机酸(主含延胡索酸)，以及多种微量元素如Ge、P、Fe、Ca、Mn和Zn等。灵芝能够调节和增强人体免疫力，降血脂血糖、保肝，抑制肥胖和动脉硬化，阻止胆固醇吸收；对神经衰弱、冠心病、高血压、慢性支气管炎、糖尿病和肿瘤等有良好的预防和治疗作用。最新研究还表明：灵芝还具有抗疲劳、美容养颜、延缓衰老、防治艾滋病等功效。目前，灵芝已作为药物正式被国家药典收载，同时它又是国家批准的新资源食品，可以药食两用。现代医学证明：灵芝多糖能够调节和增强人体免疫力，从而用于肿瘤、糖尿病、艾滋病等重大疾病的预防和防治；如Bao-MeiShao等报道了灵芝多糖的免疫活性(ImmunereceptorsforpolysaccharidesfromGanodermalucidum,BiochemicalandBiophysicalResearchCommunication323(2004)133-141)，以及ChenXP等揭露了灵芝多糖对自由基的清除作用和对宫颈癌小鼠体内抗氧化酶、免疫活性的影响(FreeradicalscavengingofGanodermalucidumpolysaccharidesanditseffectonantioxidantenzymesandimmunityactivitiesincervicalcarcinomarats，CarbohydratePolymers,2009,77(2),399)。经查阅文献，活性研究基本使用高纯度的灵芝多糖；灵芝三萜酸类化合物是近年来发现的除灵芝多糖外的另一类具有明显药理活性的化合物，自1982年Kubota等首次从赤芝子实体中分离得到三萜类化合物灵芝酸A和B以来，灵芝酸的研究备受关注，到目前为止，已先后从灵芝子实体中分离得到100多种三萜酸类化合物。灵芝酸一般分布在子实体的外周部位，而且随子实体成熟度的提高而递增，该类物质具有保肝、抗肿瘤、降血糖、抑制组胺释放等功能(EnhancementofIL-2andIFN-gexpressionandNKcellsactivityinvolvedintheantitumoreffectofganodericacidMeinvivo.InternationalImmunopharmacology，2007，7(6)：864-870；Structure-activityrelationshipforinhibitionof5a-reductasebytriterpenoidsisolatedfromGanodermalucidum.Bioorganic&MedicinalChemistry，2006,14(24)：8654-8660)；此外，灵芝还是氨基酸的“贮存库”，有17中氨基酸，其中有7种是人体内必须的氨基酸，氨基酸占灵芝的10％以上，总的氨基酸中游离态氨基酸占30％-35％，其余的多数和多糖结合成糖肽链，而且这些氨基酸容易被人体吸收，所以常作为保健品使用，受到人们的青睐。综上所述，目前对灵芝活性成分的药理研究已很明确，在临床或保健需求量大，随着人们对医疗保健水平要求的提高，对药用物质基础的明确化要求更高，所以对灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸的提取纯化并作为原料药用于药品、保健品等方法具有重要的意义。目前对于灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸单独纯化的报道很多，但普遍存在工艺复杂，收率不高，不能综合利用，造成了资源浪费；另外，由于灵芝内活性组分的理化性质差别较大，一般的提取方法都是双溶剂二次提取才能充分的提取灵芝活性成分，大大增加了生产成本，而且有些有效组分分布在细胞壁内，不经过物理或化学方法破壁很难将活性组分提取出来，给提取工艺带来了一定的困难，传统的工艺如超微粉碎、高压爆破等物理处理方法虽然能达到破壁的效果，但是成本高，后续工艺处理较为麻烦，从而不能得到广泛应用，如申请号为200810151025.6，名称为“利用超高压提取灵芝子实体多糖的方法”，采用了超高压提取方法提取灵芝多糖，该提取方法成本较高、存在安全隐患，不利于生产推广，而且在超高压环境下可能会导致活性成分结构发生变化，由于没有后续纯化处理工艺，只能得到粗多糖；如公开号为CN1560072A，名称为“一种从灵芝中制备灵芝三萜酸和灵芝多糖的方法”，该方法采用超临界萃取技术进行活性成分提取，该技术成本高，不易于生产推广，而且缺少后续纯化工艺，得到的灵芝三萜酸含量(60.2％)及灵芝多糖含量(36％)均较低。另外，目前针对于灵芝活性成分的提取纯化方法，尚未将灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸进行同时提取的研究，如何能够实现这三种有效成分的同时提取，节约提取纯化程序，有待进一步的研究开展。因此，急需提供一种能够同步提取纯化灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸活性成分的方法，并大大提高上述三种活性成分的纯度，提高其得率。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸的同步提取纯化方法，大大提高活性成分的纯度，并简化纯化工序，降低成本，提高灵芝产品的效益。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为，一种灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸的同步提取纯化方法，包括以下步骤：(1)将灵芝子实体粉碎后过筛，加入碱液及还原剂于0—5℃进行超声提取，对提取液离心得离心液和药渣；所述还原剂包括硼氢化钠、亚硫酸氢钠或亚硫酸钠中的一种，还原剂与灵芝子实体的重量比为1:20，所述碱液的浓度为0.3-1mol/L；(2)将步骤(1)所得离心液调pH值至2-4，放置8-16小时，离心，分别收集离心清液和沉淀；(3)氨基酸和灵芝多糖的提取纯化：(a)将步骤(2)中的离心清液通过陶瓷微滤膜过滤，收集过滤液及未透过液；(b)将步骤a中的过滤液通过阳离子交换树脂吸附，依次用纯化水、碱液洗脱，以茚三酮显色反应检测氨基酸，收集碱液洗脱过程中呈阳性反应的洗脱液，洗脱液调pH至4-7，加热沸腾2小时，冷却，放置8-16小时，过滤，将滤液减压浓缩，浓缩物真空干燥，打粉混匀，即得棕色粉末氨基酸；(c)将步骤a中的未透过液加入无水乙醇至含醇量为5-30％，醇沉，离心，收集离心液，再加入无水乙醇至含醇量50-95％，醇沉，离心，收集沉淀；(d)将步骤c中的沉淀使用有机试剂法除蛋白，减压回收残留有机试剂，浓缩液通过阴离子交换树脂吸附，依次使用纯化水、盐溶液洗脱，以硫酸-蒽酮法检测多糖，收集呈阳性反应的洗脱液；(e)将步骤d中的洗脱液合并，超滤纯化，收集未透本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸的同步提取纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将灵芝子实体粉碎后过筛，加入碱液及还原剂于0‑5℃进行超声提取，对提取液离心得离心液和药渣；所述还原剂包括硼氢化钠、亚硫酸氢钠或亚硫酸钠中的一种，还原剂与灵芝子实体的重量比为1:20，所述碱液的浓度为0.3‑1mol/L；(2)将步骤(1)所得离心液调pH值至2‑4，放置8‑16小时，离心，分别收集离心清液和沉淀；(3)氨基酸和灵芝多糖的提取纯化：(a)将步骤(2)中的离心清液通过陶瓷微滤膜过滤，收集过滤液及未透过液；(b)将步骤a中的过滤液通过阳离子交换树脂吸附，依次用纯化水、碱液洗脱，以茚三酮显色反应检测氨基酸，收集碱液洗脱过程中呈阳性反应的洗脱液，洗脱液调pH至4‑7，加热沸腾2小时，冷却，放置8‑16小时，过滤，将滤液减压浓缩，浓缩物真空干燥，打粉混匀，即得棕色粉末氨基酸；(c)将步骤a中的未透过液加入无水乙醇至含醇量为5‑30％，醇沉，离心，收集离心液，再加入无水乙醇至含醇量50‑95％，醇沉，离心，收集沉淀；(d)将步骤c中的沉淀使用有机试剂法除蛋白，减压回收残留有机试剂，浓缩液通过阴离子交换树脂吸附，依次使用纯化水、盐溶液洗脱，以硫酸‑蒽酮法检测多糖，收集呈阳性反应的洗脱液；(e)将步骤d中的洗脱液合并，超滤纯化，收集未透过液，将未透过液进行低温真空干燥，即得类白色海绵状干燥物灵芝多糖；(4)将步骤(2)中的沉淀用碱液溶解，调pH至6‑8，上阴离子交换树脂，使用弱碱乙醇液洗脱，收集醋酐‑浓硫酸显色成阳性的洗脱液，洗脱液调pH至2‑6，减压回收溶剂，真空干燥，呈浅黄色固体，使用乙醇加热溶解，冷却重结晶，得白色针状结晶，真空干燥，即得灵芝总三萜酸。...

【技术特征摘要】
1.一种灵芝多糖、灵芝三萜酸及氨基酸的同步提取纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将灵芝子实体粉碎后过筛，加入碱液及还原剂于0-5℃进行超声提取，对提取液离心得离心液和药渣；所述还原剂包括硼氢化钠、亚硫酸氢钠或亚硫酸钠中的一种，还原剂与灵芝子实体的重量比为1:20，所述碱液的浓度为0.3-1mol/L；(2)将步骤(1)所得离心液调pH值至2-4，放置8-16小时，离心，分别收集离心清液和沉淀；(3)氨基酸和灵芝多糖的提取纯化：(a)将步骤(2)中的离心清液通过陶瓷微滤膜过滤，收集过滤液及未透过液；(b)将步骤a中的过滤液通过阳离子交换树脂吸附，依次用纯化水、碱液洗脱，以茚三酮显色反应检测氨基酸，收集碱液洗脱过程中呈阳性反应的洗脱液，洗脱液调pH至4-7，加热沸腾2小时，冷却，放置8-16小时，过滤，将滤液减压浓缩，浓缩物真空干燥，打粉混匀，即得棕色粉末氨基酸；(c)将步骤a中的未透过液加入无水乙醇至含醇量为5-30％，醇沉，离心，收集离心液，再加入无水乙醇至含醇量50-95％，醇沉，离心，收集沉淀；(d)将步骤c中的沉淀使用有机试剂法除蛋白，减压回收残留有机试剂，浓缩液通过阴离子交换树脂吸附，依次使用纯化水、盐溶液洗脱，以硫酸-蒽酮法检测多糖，收集呈阳性反应的洗脱液；(e)将步骤d中的洗脱液合并，超滤纯化，收集未透过液，将未透过液进行低温真空干燥，即得类白色海绵状干燥物灵芝多糖；(4)将步骤(2)中的沉淀用碱液溶解，调pH至6-8，上阴离子交换树脂，使用弱碱乙醇液洗脱，收集醋酐-浓硫酸显色成阳性的洗脱液，洗脱液调pH至2-6，减压回收溶剂，真空干燥，呈浅黄色固体，使用乙醇加热溶解，冷却重结晶，得白色针状结晶，真空干燥，即得灵芝总三萜酸。2.根据权利要求1所述的灵芝多糖、灵芝三萜酸及...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹昆，何正有，聂敏奎，尹璐，
申请(专利权)人：中国医药集团总公司四川抗菌素工业研究所，
类型：发明
国别省市：四川,51