阻断型PD-L1驼源单域抗体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种驼源单域抗体，该抗体特异识别程序性死亡受体‑配体1(PD‑L1)，能够有效阻断PD‑L1与其受体PD‑1的相互作用，其阻断效果优于上市的阿特珠单抗。具体来说，本发明专利技术公布了一种PD‑L1驼源单域抗体及其衍生蛋白的编码序列、制备方法和用途。

Blocking PD-L1 Camel-derived Single Domain Antibody and Its Application

【技术实现步骤摘要】
阻断型PD-L1驼源单域抗体及其用途
本专利技术涉及生物医学或生物制药
，更具体地涉及一种抗PD-L1的驼源单域抗体及其应用。
技术介绍
肿瘤免疫逃逸是肿瘤细胞通过自身或微环境的改变来逃避集体的免疫识别和攻击。肿瘤免疫治疗因其损伤小且能有效控制肿瘤生长和转移等优势，成为临床肿瘤治疗的迫切需要。程序性死亡因子1/程序性死亡因子1配体1(PD-1/PD-L1)作为一对负性免疫共刺激分子参与了肿瘤免疫逃逸。PD-1/PD-L1是CD28/B7协同刺激分子超家族的新成员，可以介导负性协同刺激信号，能有效抑制T、B细胞功能和增殖，同时减少细胞因子IL-2、IL-10和IFN-γ的分泌，该抑制途径参与的免疫调节在肿瘤免疫、移植免疫、病毒感染、自身免疫等疾病的研究中都具有重要意义。程序性死亡因子1配体1(programmeddeath1ligand1，PD-L1)又称CD274，是B7家族成员。PD-L1属于I型跨膜蛋白，分子量约为30-35KD。其受体PD-1是免疫球蛋白B7-CD28家族成员之一，由胞外段、疏水性跨膜区、胞内段组成，其胞内段含有免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptortyrosine-basedinhibitorymotif,ITIM)、免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptortyrosine-basedswitchmotif,ITSM)。其中，ITSM的激活与效应性T细胞应答活性密切相关。PD-1可表达于活化的CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、自然杀伤T细胞、单核细胞和树突状细胞上。另外，PD-1也表达于调节性T细胞(regulatoryTcell,Treg)，并能促进Treg细胞的增殖，抑制免疫应答。人PD-L1分子可组成性表达于胎盘、心、肝、肺、肾、骨骼肌和部分造血细胞等非淋巴组织，在胸腺、淋巴结和脾脏等淋巴组织中也有适度表达。此外，PD-L1在肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等癌组织细胞上也具有表达，且癌组织经过诱导亦可上调其表达。在健康的机体中，PD-1/PD-L1信号通路的激活可最大程度减少免疫反应对周围组织的损伤，避免发生自身免疫疾病。然而，PD-1/PD-L1信号通路激活改变肿瘤局部微环境使得T细胞免疫效应降低，从而介导肿瘤免疫逃逸，促进肿瘤生长。PD-L1在肿瘤上的表达与食管癌、胰腺癌和其它类型的癌症的生存率下降相关，突出了该通路可以作为新的有前途的肿瘤免疫治疗靶点，并以得到诸多实验证实。单域抗体作为一种新型的小分子抗体片段，由驼类天然的重链抗体重链可变区(VHH)克隆获得。单域抗体的分子量仅有12-15KD，是常规单克隆抗体的十分之一，尺寸只有2-4nM，因此也被称作纳米抗体(Nanobody，Nb)。单域抗体具有优良的生物学特性，不仅拥有完整的抗原结合位点，还能够克服天然抗体分子量大的弊端，具有很好的组织穿透性，特异性高，水溶性好。因其特殊的结构性质，兼具了传统抗体与小分子药物的优势，几乎避免了传统抗体的开发周期长，稳定性较低，保存条件苛刻等缺陷，在免疫诊断和治疗中显示出广阔的应用前景。本研究领域仍亟需能与PD-L1结合，且可以阻断PD-L1/PD-1结合的抗体，尤其是抗PD-L1单域抗体。
技术实现思路
本专利技术第一方面，提供了一种抗PD-L1单域抗体VHH链的互补决定区CDR，所述VHH链的互补决定区CDR包含：SEQIDNO.:5所示的CDR1、SEQIDNO.:6所示的CDR2，SEQIDNO.:7所示的CDR3。本专利技术第二方面，提供了一种抗PD-L1单域抗体的VHH链，所述VHH链包括框架区FR和本专利技术第一方面所述的互补决定区CDR。在另一优选例中，所述的框架区FR选自下组的一种或多种：(a)SEQIDNO.:1所示的FR1，SEQIDNO.:2所示的FR2，SEQIDNO.:3所示的FR3，SEQIDNO.:4所示的FR4组成；(b)SEQIDNO.:10所示的FR1，SEQIDNO.:11所示的FR2，SEQIDNO.:12所示的FR3，SEQIDNO.:13所示的FR4组成。本专利技术第三方面，提供了一种抗PD-L1单域抗体，它是针对PD-L1表位的单域抗体，并且具有本专利技术第二方面所述的VHH链。在另一优选例中，所述单域抗体包括单体和/或二聚体。在另一优选例中，所述单域抗体如SEQIDNO.:8和/或SEQIDNO.:14所示本专利技术第四方面，提供了一种PD-L1单域抗体-Fc融合蛋白，所述融合蛋白P从N’-C’端具有如下元件：A-Fc；其中，A元件为SEQIDNO.:14所示的序列；“-”代表肽键。在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:16所示。在另一优选例中，所述IgG来源于人。本专利技术第五方面，提供了一种抗PD-L1单域抗体四价体，所述四价体具有如下结构A-L-P～P-L-A；其中，P元件为本专利技术第三方面所述的融合蛋白，A元件为SEQIDNO.:14所示的序列；L代表连接子；“-”代表肽键；“～”代表二硫键。在另一优选例中，所述连接子选自以下序列：GGGGSGGGS、GS、(GGGGS)n，其中n＝1或2或3或4。在另一优选例中，所述PD-L1单域抗体四价体的氨基酸序列如SEQIDNO.:18所示。本专利技术第六方面，提供了一种多核苷酸或其组合，所述多核苷酸编码选自一种或多种蛋白质：本专利技术第一方面所述的抗PD-L1单域抗体VHH链的CDR区、本专利技术第二方面所述的抗PD-L1单域抗体的VHH链、本专利技术第三方面所述的抗PD-L1单域抗体、或本专利技术第五方面所述的四价体。在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组的一种或多种：SEQIDNO.:9、15、18所示的核苷酸序列。在另一优选例中，SEQIDNO.:18所示的序列编码SEQIDNO.:18所示的抗体氨基酸序列。本专利技术第七方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本专利技术第六方面所述的多核苷酸或其组合。本专利技术第八方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本专利技术第七方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本专利技术第六方面所述的多核苷酸或其组合。在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母细胞、噬菌体。在另一优选例中，所述原核宿主细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核宿主细胞可以为如巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，如草地粘虫等昆虫细胞，如烟草等植物细胞，如BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施方案中，本专利技术所述宿主细胞优选为哺乳动物细胞，更优选HEK293细胞、CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞或COS细胞。本专利技术第九方面，提供了一种产生抗PD-L1单域抗体的方法，包括步骤：(a)在适合产生单域抗体的条件下，培养本专利技术第八方面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗PD-L1单域抗体的培养物；(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗PD-L1单域抗体；和任选的(c)分离和/或纯化步骤(b)所获得的PD-L1单域抗体。本专利技术第十方面，提供了本专利技术第三方面所述抗PD-L1单域抗体经化学标记或生物标记制得的结合物。在另一优选例中，所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物；所述生物标记为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗PD‑L1单域抗体VHH链的互补决定区CDR，其特征在于，所述VHH链的互补决定区CDR包含：SEQ ID NO.:5所示的CDR1、SEQ ID NO.:6所示的CDR2，SEQ ID NO.:7所示的CDR3。

【技术特征摘要】
1.一种抗PD-L1单域抗体VHH链的互补决定区CDR，其特征在于，所述VHH链的互补决定区CDR包含：SEQIDNO.:5所示的CDR1、SEQIDNO.:6所示的CDR2，SEQIDNO.:7所示的CDR3。2.一种抗PD-L1单域抗体的VHH链，其特征在于，所述VHH链包括框架区FR和权利要求1所述的互补决定区CDR。3.如权利要求2所述的VHH链，其特征在于，所述的框架区FR选自下组的一种或多种：(a)SEQIDNO.:1所示的FR1，SEQIDNO.:2所示的FR2，SEQIDNO.:3所示的FR3，SEQIDNO.:4所示的FR4组成；(b)SEQIDNO.:10所示的FR1，SEQIDNO.:11所示的FR2，SEQIDNO.:12所示的FR3，SEQIDNO.:13所示的FR4组成。4.一种抗PD-L1单域抗体，其特征在于，它是针对PD-L1表位的单域抗体，并且具有权利要求2所述的VHH链。5.如权利要求4所...

【专利技术属性】
技术研发人员：万亚坤，朱敏，沈晓宁，
申请(专利权)人：上海洛启生物医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31