抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU79-02及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备及应用，是利用细胞工程、抗体工程技术，获得分泌抗血凝素蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，通过同品系的小鼠诱导腹水，制备抗血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU79‑02，鉴定为IgG1、κ型，再通过亲和纯化、电泳、免疫等技术实现对该抗体的应用。本发明专利技术的优点在于ZJU79‑02具备抗病毒效应，在细胞及动物体内均得到验证，将为抗H7N9禽流感病毒的预防与治疗提供新的参考方案。

Anti-H7N9 Avian Influenza Virus Hemagglutinin Protein Monoclonal Antibody ZJU79-02 and Its Application

【技术实现步骤摘要】
抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU79-02及其应用
本专利技术属于生物
，涉及抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备及应用，是利用细胞工程、抗体工程技术，获得分泌抗血凝素蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，通过同品系的小鼠诱导腹水，制备抗血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU79-02，鉴定为IgG1、κ型，再通过亲和纯化、电泳、免疫等技术实现对该抗体的应用。
技术介绍
H7N9禽流感是一种新型禽流感，于2013年3月底在中国上海和安徽率先发现。到目前为止，H7N9禽流感在中国已出现5波疫情，并且在加拿大、马来西亚和澳大利亚也有人感染H7N9的报道。在2016年10月开始的第五波H7N9疫情中观察到H7N9感染人数急剧增加，感染范围向西部省份蔓延，以及出现人感染高致病性H7N9禽流感病例。H7N9禽流感对人的致病性强和死亡率高，感染者有一半以上会发生重症肺炎，且死亡率高达30％以上。其次，该病毒对家禽致病性弱，家禽患病不易被发现，从而不能做到对人的及时防护处理。目前临床上H7N9禽流感的标准疗法是早期应用神经氨酸酶抑制剂(奥司他韦、帕拉米韦和扎那米韦)。但抗病毒药物的最佳治疗时间窗较短，在症状出现超过5天后才开始抗病毒治疗时死亡风险增加。另外，临床研究发现使用奥司他韦治疗后H7N9病毒神经氨酸酶基因会出现突变，导致对奥司他韦出现耐药。另外在体外实验中也证实这些基因突变会导致H7N9对帕拉米韦和扎那米韦产生耐药。目前治疗性抗体药物研发已经成为生物技术药物领域的热点，使用治疗性抗体治疗H7N9感染具有良好前景。已有研究证明在疾病早期(发病后96小时内)给予含有中和性抗体的恢复期血浆对疾病转归具有极大的益处。但恢复期血浆有导致发热和过敏反应、输血相关的急性肺损伤等风险。而单克隆抗体具有特异性高、靶向性强、毒副作用低等优点，因此发展一种针对H7N9禽流感的中和性单克隆抗体迫在眉睫。基于以上背景，本项目选定血凝素蛋白为靶抗原，采用融合杂交瘤技术建立稳定分泌抗血凝素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，并大量制备、纯化和鉴定这些单克隆抗体。该单克隆抗体的成功获得，为治疗新型H7N9禽流感病毒感染提供新思路。本专利技术用到杂交瘤细胞技术。该技术将免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以建立分泌均质抗体的杂交瘤细胞系，也称为单克隆抗体技术。该技术涉及到动物免疫、细胞培养、细胞融合、细胞克隆培养和免疫测定等一系列方法。
技术实现思路
为了解决以上问题，本专利技术提供了一种快速敏捷检测H7N9禽流感病毒的单克隆抗体。本专利技术的目的是提供一种抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体，能特异性识别H7N9禽流感病毒并发挥抗病毒效应。该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，命名为ZJU79-02。抗体的重链氨基酸序列如SEQIDNo.2(DNA序列如SEQIDNo.1)，轻链氨基酸序列如SEQIDNo.4(DNA序列如SEQIDNo.3)所示。所述抗体由杂交瘤细胞产生。所述杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的杂交瘤细胞系ZJU79-02，能稳定分泌抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU79-02。另外本专利技术提供了一种所述的单克隆抗体ZJU79-02的制备方法，通过以下步骤和技术方案实现：(1)动物的免疫：选择6周龄的BALB/C小鼠，以纯化的H7N9禽流感病毒血凝素蛋白对小鼠进行免疫。血凝素蛋白由H7N9禽流感病毒减毒株接种鸡胚，培养并收获病毒液，经甲醛灭活、纯化、裂解及再纯化等方法，以磷酸缓冲液稀释制备获得。(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使之保持良好的生长状态，用于细胞融合。(3)细胞融合：采用聚乙二醇融合法。以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，于96孔培养板中接种BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞，并用含20％牛血清的次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶培养基培养一天。将(1)中备好的小鼠处死，获取脾脏淋巴细胞。收集(2)中的SP2/0。将上述两种细胞混合离心，然后以聚乙二醇介导细胞融合。融合后的细胞适当稀释，接种至饲养细胞培养板，适当条件培养。(4)杂交瘤细胞的筛选：将上述培养物在次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶选择性培养基中培养。在细胞集落长到大小合适时，吸取细胞培养上清液做抗体鉴定，筛选阳性克隆。(5)杂交瘤细胞的克隆化：以有限稀释法克隆杂交瘤细胞，即将稀释到一定密度的细胞接种至96孔板，使每孔只有一个细胞生长。形成细胞集落的孔取培养上清液做酶联免疫吸附实验，鉴定阳性克隆。重复有限稀释若干次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100％。将克隆化后的杂交瘤细胞扩大培养做抗体鉴定及理化性状分析。(6)单抗腹水的诱导：在接种杂交瘤细胞前一周，给每只BALB/C小鼠腹腔注射石蜡油0.5毫升，然后接种5×106个阳性杂交瘤细胞每只，10天后收集腹水离心，测定抗体效价，并纯化单克隆抗体。(7)单克隆抗体的纯化：利用ProteinG亲和纯化法纯化腹水中的单克隆抗体。本专利技术得到一个产生抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体杂交瘤系，即ZJU79-02，ZJU79-02杂交瘤细胞系经4次克隆化，持续培养六月余，分泌抗体稳定。该细胞株经液氮冻存，复苏后生长良好，抗体分泌未见衰退。酶联免疫吸附实验法测得ZJU79-02培养上清效价为1:640，腹水效价分别为1:25600。经单克隆抗体免疫球蛋白亚型分析显示该杂交瘤细胞产生的抗体类型为IgG1、κ型。本专利技术提供产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，它是由免疫的BALB/C小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的小鼠杂交瘤细胞系ZJU79-02，能稳定分泌抗H7N9禽流感病毒HA蛋白的单克隆抗体ZJU79-02。本专利技术的另一个目的是提供抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU79-02用于制备中和H7N9禽流感病毒的产品中的应用。还提供了单克隆抗体ZJU79-02能有效结合、中和H7N9禽流感病毒及其使用方法。本专利技术的优点在于ZJU79-02具备抗病毒效应，在细胞及动物体内均得到验证，将为抗H7N9禽流感病毒的预防与治疗提供新的参考方案。说明书附图图1为单克隆抗体ZJU79-02的免疫球蛋白亚型分析。图2为单克隆抗体ZJU79-02的效价检测。注：阴性对照：小鼠IgG1无关抗体，为对照组；效价光密度值≥0.5即为单克隆抗体的有效浓度范围；每个稀释度含2个复孔。图3为单克隆抗体ZJU79-02体外中和效应检测。注：A：ZJU79-02针对低致病性H7N9禽流感病毒(A/Zhejiang/DTID-ZJU01/2013)的体外中和效应；B：ZJU79-02针对高致病性H7N9禽流感病毒(A/Guangdong/HP001/2017)的体外中和效应。每个稀释度含4个复孔。图4为单克隆抗体ZJU79-02在小鼠体内的预防效果。注：A：小鼠体重变化曲线；B：小鼠生存曲线。图5为单克隆抗体ZJU79-02在小鼠体内的治疗效果。单抗ZJU79-02在小鼠体内的治疗效果。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU79‑02，抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.2，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，能与禽流感病毒血凝素蛋白抗原特异结合。

【技术特征摘要】
1.一种抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU79-02，抗体的重链氨基酸序列如SEQIDNo.2，轻链氨基酸序列如SEQIDNo.4所示；该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，能与禽流感病毒血凝素蛋白抗原特异结合。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体ZJU79-02，其特征在于：所述抗体由杂交瘤细胞产生。3.根据权利要求1所述的单克隆抗体ZJU79-02，其特征在于：所述杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的杂交瘤细胞系ZJU79-02，能稳定分泌抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU79-02。4.权利要求1所述的抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU79-02的制备方法，其特征在于：该单克隆抗体通过的以下步骤获得：(1)小鼠免疫：选择6周龄的BALB/C小鼠，以纯化的H7N9禽流感病毒血凝素蛋白对小鼠进行免疫；每只小鼠以30微克的抗原蛋白混合佐剂后大腿内侧肌肉注射免疫，第21天后再免疫一次，共2次；第3次加强免疫3天后用于融合；(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使其保持良好的生长状态，用于杂交瘤细胞融合；(3)细胞融合：采用聚乙二醇细胞融合法；以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，于96孔培养板中接种...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴海波，吴南屏，姚航平，杨帆，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属第一医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33