本发明专利技术公开了与黄芩素抗癌活性相关的两个氧化磷酸化通路关键蛋白，所述关键蛋白为ATP5A1(P25705)和ATP5F1(P24539)。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术提供了与黄芩素抗癌活性密切相关的两个细胞氧化磷酸化通路关键蛋白ATP5A1(P25705)，ATP5F1(P24539)，二者是开发抗癌新药的新靶点；同时利用黄芩素探针探索出的黄芩素与ATP5A1(P25705)/ATP5F1(P24539)结合的区域“VVDALGNAIDGKGPIGSK”、“GYLDKLEPSK”以及“TSIAIDTIINQK”，是重要的药物设计位点及区域。
Two key proteins of oxidative phosphorylation pathway related to the anticancer activity of baicalein
【技术实现步骤摘要】
与黄芩素抗癌活性相关的两个氧化磷酸化通路关键蛋白
本专利技术涉及化学生物学
，具体涉及与黄芩素抗癌活性相关的两个氧化磷酸化通路关键蛋白。
技术介绍
癌症一直是人类大敌，据世界卫生组织最新统计(http://gco.iarc.fr/today)，仅2018年，全球癌症患者1800万，因癌死亡人数超过900万；我国癌症患者420万，因癌死亡人数超过280万。尤其是我国的肝癌患者及死亡人数均已超过世界肝癌发病及死亡人数的50％。预计到2030年，我国每年因肝癌死亡的人数就将超过60万。针对肝癌的治疗最有效的办法是肝脏移植，但是因为手术费用高昂、合适的捐献者稀少，因此极大地限制了其临床应用(Forneretal.,2012)。现在主要的治疗策略是化疗药物干预(Caoetal.,2012；ElDikaandAbou-Alfa,2017；GeandHuang,2015)，但是现有化疗药物表现出的药源性肝损伤却让肝癌患者雪上加霜(BahirwaniandReddy,2014)。因此，探索并且发现具有选择性杀伤肝癌细胞的精准抗癌新策略势在必行(CouriandPillai,2019)。天然产物在抗癌药物开发中一直扮演着重要角色，无论是紫杉醇还是喜树碱，都成为了抗癌明星(Zhouetal.,2016b)；雷帕霉素，作为天然大环内酯类分子，更是导致了一个新机制(mTOR通路)的发现，从而开创了一个药物发现的新时代(Gopalakrishnanetal.,2018；MurrayandTee,2018；Scottetal.,2009)。值得一提的是，有一些天然产物表现出了选择性杀伤癌细胞的独特生物活性，如中药黄芩中的活性成分黄芩素。根据现有文献表明，黄芩素不仅具有广谱的抗癌效果，而且表现出了对神经胶质瘤、乳腺癌等肿瘤细胞特异杀伤而对相应的正常细胞细胞毒性较小的精准抗癌活性(Parajulietal.,2009；Zhengetal.,2014)。而先前的研究也发现了，黄芩素对于肝癌细胞具有抗癌活性。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了与黄芩素抗癌活性相关的两个氧化磷酸化通路关键蛋白。基于黄芩素的抗癌活性导向，申请人设计并合成了不同于现有研究的全新的黄芩素探针，并将应用该探针完成黄芩素抗肝癌机制的研究。最终在肝癌细胞系及肝癌小鼠的肝脏中，发现了黄芩素的全新作用靶标——氧化磷酸化通路中两个关键蛋白。通过对其敲低实验，证实了这两个关键蛋白对黄芩素抗癌活性至关重要。进一步，还通过生物物理学等技术，证明了黄芩素与这两个作用靶蛋白的相互作用机制。。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：与黄芩素抗癌活性相关的两个氧化磷酸化通路关键蛋白，所述关键蛋白为ATP5A1(P25705)和ATP5F1(P24539)。进一步的，上述的与黄芩素抗癌活性相关的两个氧化磷酸化通路关键蛋白，所述关键蛋白是通过黄芩素活性探针鉴定得到的。进一步的，上述的与黄芩素抗癌活性相关的两个氧化磷酸化通路关键蛋白，所述黄芩素活性探针，是以黄芩素为反应基团，二吖丙啶为光交联基团，炔基为生物正交基团；其结构式如下：进一步的，上述的与黄芩素抗癌活性相关的两个氧化磷酸化通路关键蛋白，所述黄芩素活性探针的合成步骤如下：1)合成双吖丙啶-炔基“手臂”；2)将2.7g，10mmol的黄芩素和1.25g，14.0mmol的NaOAc溶解在15mL乙酸酐中，并将溶液在75℃下搅拌直至起始物质消失；3)将步骤2)得到的反应混合物倒入150mL冰水中，过滤收集沉淀物并用乙醇EtOH洗涤，得到3.56g，90％的化合物乙酰黄芩素，为浅白色粉末；4)取1当量双吖丙啶-炔基“手臂”，1当量乙酰黄芩素，2当量碳酸钾，在无水丙酮中回流24小时；5)将步骤4)得到的回流产物，干燥加载硅胶柱后得到产物黄芩素探针，其反应式如下：本专利技术的技术关键点为：1)利用黄芩素探针探索其抗癌靶点的方法；2)与黄芩素抗癌活性密切相关的细胞氧化磷酸化通路中关键蛋白ATP5A1(P25705)，ATP5F1(P24539)是开发抗癌新药的新靶点。3)利用黄芩素探针探索与其结合的蛋白的作用区域的方法；4)黄芩素与ATP5A1(P25705)/ATP5F1(P24539)结合的区域“VVDALGNAIDGKGPIGSK”、“GYLDKLEPSK”以及“TSIAIDTIINQK”，是重要的药物设计位点及区域。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供了与黄芩素抗癌活性密切相关的两个细胞氧化磷酸化通路关键蛋白ATP5A1(P25705)，ATP5F1(P24539)，二者是开发抗癌新药的新靶点；同时利用黄芩素探针探索出的黄芩素与ATP5A1(P25705)/ATP5F1(P24539)结合的区域“VVDALGNAIDGKGPIGSK”、“GYLDKLEPSK”以及“TSIAIDTIINQK”，是重要的药物设计位点及区域。附图说明图1显示为黄芩素在细胞及动物肝癌模型中抗癌效果。其中，A为黄芩素的结构；B为使用MTT(四唑盐)比色法测定(n＝6)评估黄芩素在永生化正常肝细胞系L-02、肝癌细胞系HuH7及HepG2中剂量依赖性细胞毒性；C为黄芩素对正常及肝癌小鼠肝癌病理切片及体重。Saline：生理盐水；Baicalein：黄芩素；IC50：半数致死量。图2显示为黄芩素抗癌药效靶标鉴定。其中，A为黄芩素探针及其简要合成路线；B为基于SILAC-ABPP技术在细胞层面鉴定黄芩素直接作用靶标的技术流程图(包括“BP对照(探针对照组)”、“UV对照(紫外对照组)”和“Competition(竞争对照组)”在内的三组实验)以及相关靶标ATP4A(P20648)，ATP5A1(P25705)，ATP5F1(P24539)，ATP5L(O75964)，ATP6V1A(P38606)，ATP6V1H(Q9UI12)，ATP12A(P54707)以及NDUFA13(Q9P0J0)；C为基于SIDL-ABPP技术在组织层面鉴定黄芩素直接作用靶标的技术流程图(包括“BP对照(探针对照组)”、“UV对照(紫外对照组)”和“Competition(竞争对照组)”在内的三组实验)以及相关靶标ATP5A1(P25705)和ATP5F1(P24539)。Baicalein：黄芩素；Baicaleinprobe(或BP)：黄芩素探针；UV：紫外照射。图3显示为黄芩素药效靶标与其抗癌活性的生物学验证。其中，A为利用RNA干扰敲低黄芩素关键靶标的敲低效率，表明目标靶标的量都被显著敲低了；B为在HuH7细胞中RNAi敲低八个靶标蛋白的每一种均不同程度的消除了黄芩素在HuH7细胞中的抗癌作用，对于所有数据，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，％为黄芩素给药组相对于DMSO对照组细胞活性的比例，n＝6；C为使用MTT(四唑盐)比色法测定(n＝6)评估黄芩素在敲低ATP5A1(P25705)和/或ATP5F1(P24539)的肝癌细胞系HuH7中剂量依赖性细胞毒性；D为使用MTT(四唑盐)比色法测定(n＝6)评估黄芩素在敲低ATP5A1(P25705)和/或ATP5F1(P24539)的肝癌细胞系HepG2中剂量依赖本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.与黄芩素抗癌活性相关的两个氧化磷酸化通路关键蛋白，其特征在于，所述关键蛋白为ATP5A1(P25705)和ATP5F1(P24539)。
【技术特征摘要】
1.与黄芩素抗癌活性相关的两个氧化磷酸化通路关键蛋白，其特征在于，所述关键蛋白为ATP5A1(P25705)和ATP5F1(P24539)。2.根据权利要求1所述的与黄芩素抗癌活性相关的两个氧化磷酸化通路关键蛋白，其特征在于，所述关键蛋白是通过黄芩素活性探针鉴定得到的。3.根据权利要求2所述的与黄芩素抗癌活性相关的两个氧化磷酸化通路关键蛋白，其特征在于，所述黄芩素活性探针，是以黄芩素为反应基团，二吖丙啶为光交联基团，炔基为生物正交基团；其结构式如下：4.根据权利要求3所述的与黄芩素抗癌活性相关的两个氧化磷酸化通路关键蛋白，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：戴建业，王初，乔宁，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62
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