一种可扩展的合成寡核苷酸肽缀合物的操作方法技术

本发明专利技术公开一种合成寡核苷酸肽缀合物的方法，其包括以下步骤：a、制备叠氮基寡核苷酸和DBCO‑肽并高度纯化；b、反应准备：将DBCO‑肽溶解在DMSO中得到DBCO‑肽溶液，将叠氮基寡核苷酸溶于水或水与DMSO的混合液中得到叠氮基寡核苷酸溶液；c、偶联反应：先对叠氮基寡核苷酸进行高效液相色谱分析，再确定缀合物峰的位置，对反应产物提取样品并进行高效液相色谱分析，确定偶联反应之后反应产物的峰的位置，未反应的叠氮基寡核苷酸的峰的面积，之后进行逐步叠加反应。本发明专利技术适合大规模生产、无需进一步纯化、成本低、避免产物降解。

A Scalable Method for the Synthesis of Oligonucleotide Peptide Conjugates

【技术实现步骤摘要】
一种可扩展的合成寡核苷酸肽缀合物的操作方法
本专利技术涉及有机化学、生物化学、分子生物学
，尤其涉及一种可扩展的合成寡核苷酸肽缀合物的操作方法。
技术介绍
寡核苷酸肽缀合物（Peptide–oligonucleotideconjugates，OPCs）因其同时具备寡核苷酸和多肽的结构与活性而具有其独特的性质，广泛运用于从纳米技术到药物传递和反义技术等各个领域。多肽能识别蛋白的特殊位点，对细胞有穿透性，这样的特性与寡核苷酸的碱基对识别能力的结合，使得OPCs分子能有广泛的应用(Leonetti,Degolsetal.,1990；Soukchareun,Tregearetal.,1995)。OPCs最初被用于反义技术，即通过将一个小的DNA序列杂交到mRNA区域使其编码出想要的基因片段。OPCs非常适合用于这一类型的研究，因为OPCs分子上结合的多肽能够识别特定的细胞类型，并能将寡核苷酸进行跨膜转运，使其能选择性地在细胞内与mRNA杂交从而抑制其翻译。自最初OPCs分子被作为反义试剂以来，又出现了很多新的应用，已扩展至生物纳米技术。其中一类工作是在结构DNA纳米技术的进步上，该技术利用OPCs分子的核酸部分将单个多肽引导到DNA纳米结构表面的特定位置。比如，c-myc多肽能与一条长度为二十个碱基的短单链DNA分子偶联，所得到的缀合分子与二维DNA纳米阵列表面的DNA探针序列互补(Williams,Lundetal.,2007)。杂交完成后，铺瓦式阵列产生一个纳米级的均匀间隔64纳米的平行线图案，当用同源性的anti-c-mys抗体进行探测时，抗体能够特异性地识别出在纳米阵列表面地c-myc肽。这种在DNA纳米结构表面显示肽的技术被称为纳米显示。另外一个例子是在DNA纳米管上陈列的OPCs被用作模板，使得DNA纳米管地表面均匀分布纳米金颗粒(Williams,Lundetal.,2007)。总之，这两个例子证明OPCs分子可以在纳米层面上精确的编码生物材料和无机材料。目前已有几种不同的生产OPCs分子的方法被报道(RobertsandSzostak,1997；VenkatesanandKim,2006；Moroder,Stegeretal.,2009)，其中大多数都涉及线性固相合成步骤，即，将多肽和寡核苷酸直接在固相载体上连续偶联合成(Grandas,Marchanetal.,2007)。多肽序列首先链接到固相载体上，于C端基团上修饰一个羟基，再通过磷酸二酯键偶联第一个核甘单体，然后依次合成余下的寡核苷酸序列。连续合成法需要根据多肽合成仪肽和寡核苷酸合成仪的特点来具体设计，涉及的化学保护基团也必须同时兼容多肽和寡核苷酸的固相化学方法(VenkatesanandKim,2006)。还有片段偶联法，它是比线性的连续合成法更便捷的一种方法。在分别合成多肽和寡核苷酸以后，将两个分子通过共价化学键链接起来成为一个OPCs分子，而且共价链接基团在化学结构和性质上可以有多种选择，目前一般是通过点击化学方法生成，比如巯基和马来酰亚胺的加成反应，炔基和叠氮基的加成反应。不论是片段偶联法还是连续合成法得到的OPCs产品，在生产OPCs的过程中，保持寡核苷酸的结构完整性是至关重要的。常规的生产设计要求创建一个完全没有DNAse/RNAse污染的生产环境，但试剂、设备和维护成本相当高。并且生产过程可能要求试剂长时间接触水溶液，会不可避免地增加OPCs降解的可能性。进一步地，由于寡核苷酸合成方法本身决定的聚合度不确定性，参与偶联反应的官能团(如叠氮基)的摩尔浓度是不确定的，导致最终产品由于偶联反应不完全而存在严重的低纯度问题。一般需要通过以下一种方法或多种方法组合在一起来纯化：离子对反相色谱、离子交换色谱、凝胶电泳、透析、超滤。这些方法复杂、昂贵且低效，不适于大规模生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种适合大规模生产、无需进一步纯化、成本低、避免产物降解的可扩展的合成寡核苷酸肽缀合物的操作方法。本专利技术解决其技术问题，采用的技术方案是，提出一种可扩展的合成寡核苷酸肽缀合物的操作方法，其包括以下步骤：a、制备叠氮基寡核苷酸和DBCO-肽并高度纯化；b、反应准备：将DBCO-肽溶解在DMSO中得到DBCO-肽溶液，将叠氮基寡核苷酸溶于水或水与DMSO的混合液中得到叠氮基寡核苷酸溶液；c、偶联反应：（c1）、对叠氮基寡核苷酸进行高效液相色谱分析，其起始峰的面积为A0，取DBCO-肽溶液的量为V0添加到叠氮基寡核苷酸溶液中反应得到反应产物，其中DBCO-肽与叠氮基寡核苷酸的摩尔比为1:1.00-1.25；（c2）、确定缀合物峰的位置：对反应产物提取样品并进行高效液相色谱分析，确定偶联反应之后反应产物的峰的位置，未反应的叠氮基寡核苷酸的峰的面积为A0；（c3）、逐步叠加反应：（1）第一次叠加反应：往反应产物中添加DBCO-肽溶液的量为V1，；（2）第二次叠加反应：继续添加DBCO-肽溶液的量为V2，；（3）第n次叠加反应：继续添加DBCO-肽溶液的量为Vn，；其中，每次叠加反应后，对产物提取样品并进行高效液相色谱分析，得到未反应的叠氮基寡核苷酸的峰的面积An+1,直至An+1不再减小，结束叠加反应得到最终产物。本专利技术应用点击化学来实现片段偶联反应。为了避免重金属元素对寡核苷酸肽缀合物产品下游使用的不利影响，从一开始即必须回避基于铜催化试剂的1,3-偶极[3+2]环加成反应（1,3-dipolarcycloaddition）。本专利技术主张采用环张力促进的1,3-偶极[3+2]环加成反应，特别是二苯并氮杂环辛炔基(DBCO)与叠氮基（N3）通过环加成而得到1,2,3-三唑基团。此方法可确保寡核苷酸肽缀合物产品能够通用于活细胞、生物体以及非活体实验样本中。DBCO基团专一地标记含叠氮基的分子。在生理温度和生理酸碱度范围内，DBCO基团不会与分子生物中天然存在的活性基团巯基、胺基或者羟基进行反应。点击化学反应原理如下：作为优选，所述DBCO-肽溶液的浓度在1-10mM，所述叠氮基寡核苷酸溶液的浓度在0.1-1.0mM。作为优选，所述高效液相色谱使用紫外检测器，所述紫外检测器检测波长设置为210nm。作为优选，在步骤e之后，对最终产物进行真空冷冻干燥即可直接用于下一步实验。作为优选，在步骤b中，将叠氮基寡核苷酸溶于水或水与DMSO的混合液中得到浓度在0.1mM-100mM的叠氮基寡核苷酸溶液，其中水与DMSO混合液中，水与DMSO的混合体积比为1:1-5。作为优选，步骤（c1）中DBCO-肽与叠氮基寡核苷酸的摩尔比为1:1。作为优选，水与DMSO混合液中，水与DMSO的混合体积比为1:1。作为优选，步骤（c1）中DBCO-肽与叠氮基寡核苷酸的摩尔比为1:1。本专利技术具有如下有益效果：1.寡核苷酸容易被DNA酶或者RNA酶降解，本专利技术的方法可以避免外来酶的污染问题。2.采用点击化学法定量、即时地完成偶联反应。DBCO基团专一地标记含叠氮基的分子。在生理温度和生理酸碱度范围内，DBCO基团不会与分子生物中天然存在的活性基团巯基、胺基或者羟基进行反应。这种专一性的一对一反应效率高达95%以上。3.在高效液相色谱分析的引本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可扩展的合成寡核苷酸肽缀合物的操作方法，其特征在于，包括以下步骤：制备叠氮基寡核苷酸和DBCO‑肽并高度纯化；反应准备：将DBCO‑肽溶解在DMSO中得到DBCO‑肽溶液，将叠氮基寡核苷酸溶于水或水与DMSO的混合液中得到叠氮基寡核苷酸溶液；偶联反应：（c1）、对叠氮基寡核苷酸进行高效液相色谱分析，其起始峰的面积为A0，取DBCO‑肽溶液的量为V0添加到叠氮基寡核苷酸溶液中反应得到反应产物，其中DBCO‑肽与叠氮基寡核苷酸的摩尔比为1:1.00‑1.25；（c2）、确定缀合物峰的位置：对反应产物提取样品并进行高效液相色谱分析，确定偶联反应之后反应产物的峰的位置，未反应的叠氮基寡核苷酸的峰的面积为A1；（c3）、逐步叠加反应：（1）第一次叠加反应：往反应产物中添加DBCO‑肽溶液的量为V1，

【技术特征摘要】
1.一种可扩展的合成寡核苷酸肽缀合物的操作方法，其特征在于，包括以下步骤：制备叠氮基寡核苷酸和DBCO-肽并高度纯化；反应准备：将DBCO-肽溶解在DMSO中得到DBCO-肽溶液，将叠氮基寡核苷酸溶于水或水与DMSO的混合液中得到叠氮基寡核苷酸溶液；偶联反应：（c1）、对叠氮基寡核苷酸进行高效液相色谱分析，其起始峰的面积为A0，取DBCO-肽溶液的量为V0添加到叠氮基寡核苷酸溶液中反应得到反应产物，其中DBCO-肽与叠氮基寡核苷酸的摩尔比为1:1.00-1.25；（c2）、确定缀合物峰的位置：对反应产物提取样品并进行高效液相色谱分析，确定偶联反应之后反应产物的峰的位置，未反应的叠氮基寡核苷酸的峰的面积为A1；（c3）、逐步叠加反应：（1）第一次叠加反应：往反应产物中添加DBCO-肽溶液的量为V1，；（2）第二次叠加反应：继续添加DBCO-肽溶液的量为V2，；（3）第n次叠加反应：继续添加DBCO-肽溶液的量为Vn，，其中，每次叠加反应后，对产物提取样品并进行高效液相色谱分析，得到未反应的叠氮基寡核苷酸的峰的面积An+1，直至An+1不再减小，结束叠加反应得到最终产物。2.根据权利要求1所述的一种可扩展的合成寡核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：周剑，陈亚，
申请(专利权)人：湖州泽溪源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33