成骨活性多肽的构效评价方法技术

本发明专利技术公开一种成骨活性多肽的构效评价方法，包括以下步骤：步骤一、筛选出具有潜在成骨活性肽；步骤二、构建预备对接多肽配体库；步骤三、获得靶点蛋白晶体结构，移除靶点蛋白晶体结构中的原配体作为靶点受体蛋白；步骤四、将预备对接多肽配体库中的每个多肽靶点受体蛋白分别结合对接，选取结合位点自由能小于第一预设值的多肽，形成稳定结合多肽集群；步骤五、计算多肽集群中氨基酸序列重复出现的次数，筛选出氨基酸序列重复出现次数高于第二预设值的氨基酸序列，并将含有该氨基酸序列的多肽认定为潜在的成骨活性多肽。本发明专利技术基于计算机辅助模拟分子对接技术评价多肽的促成骨细胞增殖活性，有效节省鉴定时间和成本，评价结果数据可靠性高。

Structure-activity evaluation of osteogenic active polypeptide

【技术实现步骤摘要】
成骨活性多肽的构效评价方法
本专利技术涉及生物信息学领域，具体是一种成骨活性多肽的构效评价方法。
技术介绍
骨质疏松症是一种以骨质量减少、骨显微结构发生退化、骨脆性增加为特征的全身性机体骨代谢性疾病。临床上，治疗骨质疏松症药物包括利塞膦酸盐、对苯二甲酸、阿仑膦酸、二磷酸盐、唑来膦酸、特立帕肽等，但服用这些药物往往存在诸如食道发炎、恶心、腹痛甚至有罹患生殖系统癌变的副作用，其潜在的毒性和副作用在一定程度上限制了大范围应用。因此，寻找能够促进骨形成和逆转骨结构损伤的更安全、食物源的天然替代品正受到越来越多的关注。畜禽骨中含有丰富的胶原蛋白(主要为I型，含量约占动物鲜骨重的20％)，胶原蛋白是一种独特的结构蛋白，研究表明补充胶原蛋白肽可以增加骨胶原纤维网架的规则性和牢固性，促进钙盐有序沉积，增加骨强度和骨密度，是一种潜在的抗骨质疏松活性肽的理想来源。随着生物信息学的发展及深入研究，越来越多的蛋白质结构及其氨基酸序列得到阐明，这为从原料蛋白中寻找生物活性肽提供了氨基酸序列基础。前期实验室率先从牛骨中分离、纯化制备得到较高纯度的牛骨胶原蛋白肽，并对其氨基酸序列进行结构鉴定，构建了促成骨细胞增殖活性(成骨活性)肽库，依据与靶点蛋白结合力类型、结合位点氨基酸残基个数和种类明确了成骨活性肽氨基酸序列结构特征。传统成骨活性肽评价方法需对所有的多肽都进行人工合成，然后将所有鉴定得到的多肽分别进行人工合成和体外细胞培养验证，从而筛选获得具有成骨活性的多肽，需耗费大量时间、经济成本较高。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种成骨活性多肽的构效评价方法，其基于计算机辅助模拟分子对接技术评价多肽的促成骨细胞增殖活性，克服传统成骨活性肽评价方法费时、费力、经济成本较高的缺点，有效节省成骨活性肽鉴定时间和人力、物力成本，评价结果数据可靠性高，是一种具有较好的预测和评价成骨活性肽的方法。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种成骨活性多肽的构效评价方法，包括以下步骤：步骤一、从畜禽的骨胶原蛋白中分离出多肽，然后筛选出具有潜在成骨活性的多肽；步骤二、将步骤一中筛选出的具有潜在生物活性的多肽构建预备对接多肽配体库，并对预备对接多肽配体库中的多肽进行能量最小化处理；步骤三、从蛋白质数据库中获得靶点蛋白晶体结构，该靶点蛋白晶体结构能够参与细胞增殖，移除靶点蛋白晶体结构中的原配体作为靶点受体蛋白；步骤四、以原配体和靶点蛋白晶体结构的结合位点为活性中心，将预备对接多肽配体库中的每个多肽与步骤三中的靶点受体蛋白分别结合对接，计算结合位点自由能，选取结合位点自由能小于第一预设值的多肽，形成稳定结合多肽集群；步骤五、计算稳定结合多肽集群中氨基酸序列重复出现的次数，筛选出氨基酸序列重复出现次数高于第二预设值的氨基酸序列，并将含有该氨基酸序列的多肽认定为潜在的成骨活性多肽。优选的是，还包括：步骤六、将步骤五中获得的潜在的成骨活性多肽通过体外化学合成经HPLC纯化得到纯度大于98％的成骨活性多肽，再进行体外促成骨细胞增殖培养。优选的是，步骤三中的靶点受体蛋白为表皮生长因子受体。优选的是，步骤一中筛选时依次分为两次，第一次筛选的条件为：氨基酸数目介于5-25，且多肽分子量介于500-2500Da，且经Mascot评价得分大于40，第二次筛选的条件为：氨基酸数目介于10-25，或者氨基酸序列为GDR、GPA、GP或GA，或者特征氨基酸Gly和Pro丰度分别介于15-35％、10-40％。优选的是，步骤二中构建预备对接多肽配体库之前对具有潜在生物活性的多肽分别绘制三维结构，能量最小化处理根据CHARMm能量场进行。优选的是，步骤三中的靶点受体蛋白进行了去水、加氢处理。优选的是，步骤四中预备对接多肽配体库中的每个多肽与步骤三中的靶点受体蛋白分别结合对接前，先设置了对接活性域中心坐标以及对接的半径，并采用CDOCKER半柔性对接。优选的是，其中，对接活性域中心的坐标分别为X＝124.403，Y＝75.629，Z＝51.305，对接半径选择15-25之间的任意值；CDOCKER半柔性对接的参数设置如下：TopHit设置为10，RandomConformations设置为10，OrientationstoRefine设置为10，Forcefield设置为CHARMm，其他参数选择缺省值。优选的是，步骤四中采用CDOCKER半柔性对接后，还获得了预备对接多肽配体库中的多肽与靶点受体蛋白的结合力类型，以及结合位点氨基酸残基个数和种类，其中，结合力类型包括氢键、疏水作用、范德华力、离子键作用，结合位点的氨基酸残基包括Ser11、Asn12、Lys13、Thr15、Gln16、Leu17、Gly18、Leu325、Val350、Asp355、Phe357、His409。优选的是，第一预设值为-100kcal/mol。本专利技术至少包括以下有益效果：本专利技术通过计算机模拟分子对接技术主要依据配体与受体的“锁-匙原理”研究二者之间的相互作用方式，其遵循能量匹配和几何匹配的原则。配体与受体相互作用主要包括静电作用、氢键作用、疏水作用、范德华作用等。在执行分子对接过程中，将具有初始三维立体结构的配体放置在受体的活性位点处，根据几何互补及能量匹配的原则，对配体与受体的位置、构象、分子内部可旋转键的二面角、蛋白骨架等参数进行优化，从而找出配体与受体的最佳结合模式。本专利技术克服传统成骨活性肽评价方法费时、费力、经济成本较高的缺点，提供一种基于计算机辅助模拟分子对接技术研究多肽配体分子与受体大分子之间的作用模式和作用机制，有效节省成骨活性肽鉴定时间和人力、物力成本，评价结果数据可靠性高，是一种具有较好的预测和评价成骨活性肽的方法。本专利技术对于成骨活性多肽的构效评价方法可简化为筛选具有促成骨细胞增殖活性多肽的程序。本专利技术的方法还可以预测各氨基酸数目及组成在成骨活性肽中的贡献以及对各氨基酸的序列位置在成骨活性肽中的作用进行分析。本专利技术所述方法具有快速、高效、准确评价多肽的成骨活性强弱的优点，可操作性较强、无需大量人力物力投入，可广泛应用于具有成骨活性多肽的评价，为抗骨质疏松活性功能健康食品的开发提供新的理论和数据支撑，不仅可以满足功能健康食品加工企业前期筛查成骨活性肽的需要，还可以为今后其他生物活性肽的构效评价提供有益参考和借鉴。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本专利技术中筛选出的具有潜在生物活性的多肽的氨基酸序列及所在I型胶原蛋白肽链位置的示意图。；图2为本专利技术中的靶点蛋白晶体结构1IVO的三维晶体结构图；图3为本专利技术中预备对接多肽配体库中的多肽与靶点受体蛋白对接的结合自由能小于-100kcal/mol的多肽中重复序列的肽段(GP-16和GD-18)与表皮生长因子受体EGFR相互作用的示意图；图4为本专利技术中预备对接多肽配体库中的多肽与靶点受体蛋白对接的结合自由能小于-100kcal/mol的多肽中重复序列(GP-16和GD-18)的肽段体进行外促成骨细胞增殖活性的对比图；图5为本专利技术所述方法的流程图。具体实施方式下面结合附图和实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.成骨活性多肽的构效评价方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、从畜禽的骨胶原蛋白中分离出多肽，然后筛选出具有潜在成骨活性的多肽；步骤二、将步骤一中筛选出的具有潜在生物活性的多肽构建预备对接多肽配体库，并对预备对接多肽配体库中的多肽进行能量最小化处理；步骤三、从蛋白质数据库中获得靶点蛋白晶体结构，该靶点蛋白晶体结构能够参与细胞增殖，移除靶点蛋白晶体结构中的原配体作为靶点受体蛋白；步骤四、以原配体和靶点蛋白晶体结构的结合位点为活性中心，将预备对接多肽配体库中的每个多肽与步骤三中的靶点受体蛋白分别结合对接，计算结合位点自由能，选取结合位点自由能小于第一预设值的多肽，形成稳定结合多肽集群；步骤五、计算稳定结合多肽集群中氨基酸序列重复出现的次数，筛选出氨基酸序列重复出现次数高于第二预设值的氨基酸序列，并将含有该氨基酸序列的多肽认定为潜在的成骨活性多肽。

【技术特征摘要】
1.成骨活性多肽的构效评价方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、从畜禽的骨胶原蛋白中分离出多肽，然后筛选出具有潜在成骨活性的多肽；步骤二、将步骤一中筛选出的具有潜在生物活性的多肽构建预备对接多肽配体库，并对预备对接多肽配体库中的多肽进行能量最小化处理；步骤三、从蛋白质数据库中获得靶点蛋白晶体结构，该靶点蛋白晶体结构能够参与细胞增殖，移除靶点蛋白晶体结构中的原配体作为靶点受体蛋白；步骤四、以原配体和靶点蛋白晶体结构的结合位点为活性中心，将预备对接多肽配体库中的每个多肽与步骤三中的靶点受体蛋白分别结合对接，计算结合位点自由能，选取结合位点自由能小于第一预设值的多肽，形成稳定结合多肽集群；步骤五、计算稳定结合多肽集群中氨基酸序列重复出现的次数，筛选出氨基酸序列重复出现次数高于第二预设值的氨基酸序列，并将含有该氨基酸序列的多肽认定为潜在的成骨活性多肽。2.如权利要求1所述的成骨活性多肽的构效评价方法，其特征在于，还包括：步骤六、将步骤五中获得的潜在的成骨活性多肽通过体外化学合成经HPLC纯化得到纯度大于98％的成骨活性多肽，再进行体外促成骨细胞增殖培养。3.如权利要求1所述的成骨活性多肽的构效评价方法，其特征在于，步骤三中的靶点受体蛋白为表皮生长因子受体。4.如权利要求1所述的成骨活性多肽的构效评价方法，其特征在于，步骤一中筛选时依次分为两次，第一次筛选的条件为：氨基酸数目介于5-25，且多肽分子量介于500-2500Da，且经Mascot评价得分大于40，第二次筛选的条件为：氨基酸数目介于10-25，或者氨基酸序列为GDR、GPA、GP或GA，或者特征氨基酸Gly和Pro丰度分别介于15-35％、10-40％。5.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：张春晖，叶孟亮，贾伟，王航，李侠，张鸿儒，秦晓洁，刘云鹤，
申请(专利权)人：中国农业科学院农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11