犬恶丝虫小热休克蛋白的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了犬恶丝虫小热休克蛋白作为犬恶丝虫病诊断抗原等一系列相关应用，相关实验结果显示，犬恶丝虫小热休克蛋白能被自然感染犬恶丝虫病的犬血清识别，犬恶丝虫小热休克蛋白制备的兔抗IgG能识别犬恶丝虫小热休克蛋白，免疫犬后能够长时间维持抗体水平，具有良好的免疫原性和反应原性；同时在间接ELISA方法中表现出极高敏感性和特异性，种种结果证明犬恶丝虫小热休克蛋白可以作为犬恶丝虫病的诊断抗原，以及应用到相关疫苗和检测试剂盒中。

Application of Small Heat Shock Protein from Canine Filaria

【技术实现步骤摘要】
犬恶丝虫小热休克蛋白的应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及犬恶丝虫小热休克蛋白的应用。
技术介绍
犬恶丝虫病是一种通过蚊媒传播的人畜共患寄生虫病。犬恶丝虫(Dirofilariaimmitis)主要寄生于犬、猫的肺动脉和右心室，寄生在肺动脉的犬恶丝虫成虫可引发宿主的血管病变以及肺动脉高血压等反应。由于全球变暖增加了蚊媒的活动性，近年来有关人感染犬恶丝虫病的病例报道呈上升趋势。犬恶丝虫病的常规诊断方法主要有病原检测，血清学检测和分子生物学检测。目前，血清学检测是最常用的检测方法，分为抗原检测和抗体检测。抗原检测的假阴性结果常见于轻微感染、雌虫尚未成熟、仅感染雄虫等情况；抗体检测较抗原检测的优势在于，不论雌虫还是雄虫都能检测出来。宿主感染犬恶丝虫2个月后，幼虫刺激机体所产生的免疫反应就能被检测出来，抗体检测比抗原检测能更早地检测出犬恶丝虫，适用于犬恶丝虫病的早期检测。探索发现有效的犬恶丝虫病新诊断方法对于犬恶丝虫病的高效诊断具有重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供犬恶丝虫小热休克蛋白(Di-sHSP12.6)作为犬恶丝虫病的诊断抗原以及在制备犬恶丝虫病的诊断抗原中的应用，使得犬恶丝虫小热休克蛋白具有较高的特异性和敏感性，以及良好的免疫原性和反应原性；本专利技术的另外一个目的在于提供犬恶丝虫小热休克蛋白(Di-sHSP12.6)在制备检测犬恶丝虫病的试剂盒中的应用，使得以所述犬恶丝虫小热休克蛋白建立的ELISA方法显示出其较高的特异性和敏感性，可用于ELISA检测；本专利技术的另外一个目的在于提供犬恶丝虫小热休克蛋白(Di-sHSP12.6)在制备犬恶丝虫病疫苗中的应用，使得所述犬恶丝虫小热休克蛋白不仅能够产长时间维持较高的抗体水平，而且犬恶丝虫小热休克蛋白制备的兔抗IgG能识别犬恶丝虫小热休克蛋白，满足作为疫苗的免疫原性和反应原性的要求。在本文中，犬恶丝虫小热休克蛋白可以是非天然的，例如是合成的或者由人工载体表达的(业内常称为重组蛋白rDi-sHSP12.6)。术语“非天然的”是指目标物质不是自然界天然存在的，这并不排除所述非天然物质与天然存在的物质具有相同的结构和/或组成。在线虫中，现在已经发现了14种小分子热休克蛋白(smallheatshockprotein，sHSP)，根据分子质量的不同可以分成6组：sHSP12s(包括HSP12.1、HSP12.2、HSP12.3和HSP12.6)、sHSP16s(HSP16.1、HSP16.2、HSP16.41、HSP16.48以及新发现的F08H9.3、F08H9.4)、HSP25、HSP43、HSP17.5和胁迫诱导蛋白-1(stress-inducedprotein-1，SIP-1)，研究证实它不仅能够在应激条件下维持细胞必需的蛋白质空间构象，保护细胞生命活动以维持细胞生存，而且在蛋白质折叠、跨膜运输、转运、机体免疫、细胞凋亡、细胞骨架及核骨架稳定等基本功能上发挥着重要的作用。目前，犬恶丝虫小热休克蛋白(Di-sHSP12.6)在犬恶丝虫病中的相关研究尚未见报道。本专利技术通过原核表达得到重组犬恶丝虫小热休克蛋白(rDi-sHSP12.6，其和Di-sHSP12.6具备完全相同的氨基酸序列，如SEQIDNO:1所示)，对其进行免疫印迹，ELISA以及早期诊断方法的建立。免疫印迹结果显示重组蛋白rDi-sHSP12.6制备的兔抗IgG能识别重组蛋白rDi-sHSP12.6，重组蛋白rDi-sHSP12.6能被自然感染犬恶丝虫病的犬血清识别，不能被健康犬血清识别，说明犬恶丝虫小热休克蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。间接ELISA结果显示，用rDi-sHSP12.6蛋白检测24份犬恶丝虫阳性血清和24份犬恶丝虫阴性血清，结果显示，22份阳性血清OD450>临界值，2份阳性血清和24份阴性血清OD450<临界值(0.699)，则评估该方法的敏感性为91.6％(22/24)；同时，不与犬细粒棘球绦虫阳性血清、犬细颈囊尾蚴阳性血清和犬钩虫阳性血清(共18份)发生交叉反应，检测的18份犬弓首蛔虫阳性血清中仅有2份发生轻微的交叉反应，则评估该方法的特异性为91.6％(34/36)；综上所述，rDi-sHSP12.6具有较高的敏感性和特异性，且交叉反应率低，具有较好的诊断效果，适合作为犬恶丝虫病的诊断抗原以及作为诊断抗原制备相关的检测试剂盒。此外，本专利技术还采用重组rDi-sHSP12.6+免疫佐剂进行犬(6只)的免疫，结果显示，免疫2周后抗体达峰值，免疫后3个月犬体内仍维持较高的抗体水平，结合前述免疫印迹和间接ELISA结果，表明犬恶丝虫小热休克蛋白具备开发疫苗的潜力。基于上述内容，本专利技术提供了犬恶丝虫小热休克蛋白作为犬恶丝虫病的诊断抗原的应用，以及在制备犬恶丝虫病诊断抗原中的应用。同时，本专利技术还提供了犬恶丝虫小热休克蛋白在制备诊断犬恶丝虫病的试剂盒中的应用；其中，所述试剂盒优选为ELISA试剂盒，更具体地，该ELISA试剂盒为基于ELISA间接法的试剂盒。此外，本专利技术还提供了犬恶丝虫小热休克蛋白在制备犬恶丝虫病疫苗中的应用。由以上技术方案可知，本专利技术提供了犬恶丝虫小热休克蛋白作为犬恶丝虫病诊断抗原等一系列相关应用，相关实验结果显示，犬恶丝虫小热休克蛋白能被自然感染犬恶丝虫病的犬血清识别，犬恶丝虫小热休克蛋白制备的兔抗IgG能识别犬恶丝虫小热休克蛋白，免疫犬后能够长时间维持抗体水平，具有良好的免疫原性和反应原性；同时在间接ELISA方法中表现出极高敏感性和特异性，种种结果证明犬恶丝虫小热休克蛋白可以作为犬恶丝虫病的诊断抗原，以及应用到相关疫苗和检测试剂盒中。附图说明图1所示为Di-sHSP12.6基因的PCR扩增；其中，M为DNA分子质量标准(DL2000)；1-4：Di-sHSP12.6PCR产物；图2所示为重组质粒pET32a(+)-sHSP12.6的双酶切鉴定；其中，M：DNA分子质量标准(DL2000)；1-4：pET32a(+)-sHSP12.6的双酶切产物；图3所示为重组Di-sHSP12.6蛋白的表达；其中，M：蛋白质分子质量标准；1：IPTG诱导的未含pET32a(+)-sHSP12.6的大肠杆菌；2-4：IPTG诱导的含pET32a(+)-sHSP12.6的大肠杆菌；图4所示为rDi-sHSP12.6的可溶性分析；其中，M：蛋白质分子质量标准；1：8M尿素溶解；2：4M尿素溶解；3：2M尿素溶解；4：上清；图5所示为rDi-sHSP12.6的表达、纯化与免疫印迹分析；其中，1：IPTG诱导的未含有重组pET32a(+)-sHSP12.6的大肠杆菌；2：IPTG诱导的含有重组pET32a(+)-sHSP12.6的大肠杆菌；3：经镍柱纯化后的兔抗rDi-sHSP12.6的IgG；4：经镍柱纯化后的rDi-sHSP12.6；5：自然感染犬恶丝虫的犬阳性血清特异性识别rDi-sHSP12.6；6：经镍柱纯化后的兔抗rDi-sHSP12.6的IgG识别rDi-sHSP12.6；7：健康的阴性犬血清识别rDi-sHSP12.6；图6所示为雌性和雄性犬恶丝虫横切面Di-sHSP12.6蛋白的间接免疫荧光定位；其中，I：肠；UT：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.犬恶丝虫小热休克蛋白作为犬恶丝虫病的诊断抗原的应用和/或在制备犬恶丝虫病诊断抗原中的应用。

【技术特征摘要】
1.犬恶丝虫小热休克蛋白作为犬恶丝虫病的诊断抗原的应用和/或在制备犬恶丝虫病诊断抗原中的应用。2.犬恶丝虫小热休克蛋白在制备诊断犬恶丝虫病的试剂盒中的应用。3.根据权利要求2所述应用，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨光友，张浩杰，彭雪蓉，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51