高通量量化及分析口蹄病病毒及相关产物的方法技术

本发明专利技术提供了一种高通量方法来量化病毒及病毒分子和分析其大小和完整性。在一个实施例中，本发明专利技术的方法使用层析系统和同轴动态光散射(DLS)技术以量化和分析口蹄病病毒(FMDV)的大小和完整性。在一个实施例中，本发明专利技术还包括一个用于运行多个层析柱的切换系统以同时进行多个分析。本发明专利技术还提供了一种方法来开发和评估包含口蹄病病毒的产品以防止口蹄病。在一个实施例中，本发明专利技术的方法用于评估口蹄病病毒的稳定性。在另一个实施例中，本发明专利技术的方法用于监控制造口蹄病疫苗的过程的质量。

High throughput quantification and analysis of foot-and-mouth disease virus and related products

【技术实现步骤摘要】
高通量量化及分析口蹄病病毒及相关产物的方法此专利申请以申请号为62/009,126在2014年6月6日申请的美国专利申请作为优先权。上述提及的专利申请的所有内容和公开都结合在此申请中。在此专利申请中的所有不同的参考文献和公开都在此合并到此专利申请中从而更全面描述此专利技术从属的

本专利技术涉及口蹄病病毒(FootandMouthDiseaseVirus,FMDV)的量化和分析。本专利技术有助于开发用于预防口蹄病的产品，以及评估包含口蹄病病毒的产品。
技术介绍
口蹄病或手足口病(FootandMouthDisease,FMD)是一种急性的全身性病毒感染，主要影响供人食用的动物，例如牛﹑绵羊﹑山羊﹑猪以及其它偶蹄类动物。口蹄病的高度传染性大大影响了畜牧业的生产力和经济,因此即使其死亡率极低,口蹄病仍是畜牧业中最严重的疾病之一。口蹄病在全球多个地方流行。世界动物卫生组织(OIE)定期发布口蹄病的分布和爆发图。由于OIE对肉类贸易市场的限制,OIE颁报的卫生状况对依赖于肉类贸易的国家(特别是受口蹄病影响的国家)产生深远的经济影响。大多数发达国家通过有效的疫苗和严格的监控计划成功根除口蹄病。但即使制定了严格的国际贸易政策，口蹄病最近在欧洲(2000及2001年)和日本(2000及2010年)仍发生了大爆发。尽管很多国家的所有或部分领土范围获得OIE认可其“因接种疫苗而消除口蹄病,freefromFMDwithvaccination”的状态，但其邻近国家的口蹄病爆发仍造成持续的威胁。經過不断的努力开发,現時已不需依賴大规模地增殖病原体來獲取重组亚基疫苗,目前的疫苗都是源自經灭活的病毒，并透過浓缩和提纯這些病毒以達至一定的抗原质量,以产生具保护性的免疫反应。制造这些疫苗的厂房需符合OIE的NBS生物安全等级4的要求。估计每年全球生产的口蹄病疫苗数量為25至30亿劑。此外，很多国家建立了应急方案以确保在口蹄病爆发时可以快速地制备疫苗应急。例如将口蹄病病毒抗原冷冻储存，以建立抗原储存库。以灭活病毒制备的疫苗通常用于根除口蹄病和在紧急的情况下使用，疫苗效果大大依赖于疫苗制剂的抗原有效载荷和病毒的完整性。口蹄病病毒(FMDV)包裹在非脂质的包膜内，呈二十面体对称。口蹄病病毒的直径大小为28至40纳米。整个病毒的颗粒在体外极度不稳定，当温度超过56℃及pH值小于6时，病毒即分离成为单份子。现知有7个口蹄病病毒血清分型，分别是O型﹑A型﹑C型﹑SAT1型﹑SAT2型﹑SAT3型和Asia1型。现时一般推荐使用140S(146S)量化蔗糖密度梯度分析方法以量化病毒抗原。该方法由Barteling和Meloen(BartelingSJ,MeloenRH.Asimplemethodforthequantificationof140Sparticlesoffoot-and-mouthdiseasevirus(FMDV).ArchGesamteVirusforsch,1974；45(4):362–4)建立，在过去30年里一直被视为测定病毒浓度的可靠方法。该方法需要将样本放在20-45％浓度梯度的蔗糖中,并对此进行超速离心。蔗糖梯度可通过人手或使用简易的梯度混合器将浓度较低的蔗糖液放在浓度较高的蔗糖液上预备。146S分析方法的原理是口蹄病病毒颗粒会根据其沉降系数在相应的蔗糖梯度中分布,从而将不同的FMD病毒的颗粒分离。因此，该方法只能间接地检测病毒颗粒的完整性。尽管国际间致力将口蹄病病毒的检测方法标准化，但至今还仍未有一个普遍认可的方案或国际标准。这可能是由于检测方法涉及复杂的技术和需要特殊的设备所致(BartelingSJ.Needforfurtherstandardizationofthe146-Stestasthebasisforfinal-Foot-and-MouthDisease(FMD)Vaccineformulation.EUFMDResearchGroupMeeting1999-Appendix17)。缺乏检测口蹄病疫苗中活性成分的标准方法是引致临床试验费用高昂且繁琐的主要原因。每个批次的疫苗一般需要在临床试验中使用17-20只大型动物以进行口蹄病疫苗登记和发放疫苗。过去数十年间，人类和动物健康相关的行业见证了政府对制备药物和生物制药产品的生产质量管理规范(GoodManufacturingPractice,GMP)的规管愈来愈严格。期间出现了新的规管概念,例如过程分析技术(ProcessAnalyticalTechnology,PAT)。根据食品和药品监督管理局(FDA)的定义,PAT是一个通过测量影响关键质量参数(CriticalQualityAttributes,CQA)的关键工序参数(CriticalProcessParameters,CPP),进而设计﹑分析和控制药品生产过程的体系。对疫苗工业，特别是由完整抗原制备的疫苗(例如灭活病毒疫苗或经减毒的活性病毒疫苗)来说，需要能在纳米范围内可靠地量化和测定的颗粒大小的方法和设备以监控生产疫苗的过程。监控生产过程能确保生产过程每个步骤中的病毒抗原合符所需质量,因此十分重要。然而，涉及病毒的颗粒的生产流程复杂,因此相比普通重组蛋白(例如单克隆抗体)其分析困难很多。其中一个挑战就是当前许多疫苗的生产方法都是开发于数十年前,当时仍未有开发出无血清的培养基。因此,现时制备疫苗通常需要使用添加了包含高蛋白量血清的培养基。另外，通过感染细胞培养物而获得的病毒颗粒其产量通常每公升只有数毫克，这与重组蛋白例如单克隆抗体的表达相比小若干个数级。另一个要点是，一些病毒例如口蹄病病毒会出现裂解性复制周期。此时,细胞会被摧毁,细胞的细胞质和细胞核中的所有物质(包括遗传物质如核酸以及来自细胞膜的残留脂质)会释放到细胞培养液，这些物质的存在使分析变得更加困难。分子排阻层析法(size/molecularexclusionchromatography)根据分子的流体力学体积(hydrodynamicvolume)将不同的分子分开。因此,即使分子量不同,具有相近流体力学体积的不同分子一般在分子排阻层析柱内的流动性相近。非常复杂的生产流程一般涉及大分子量的DNA及脂质,由于这些物质的流体动力学体积与病毒相近,因此分子排阻层析法通常不能将病毒与这些物质分开。以蛋白或病毒为主的疫苗是常用的疫苗模型,用于将抗原运送到目标受体以进行免疫。疫苗的成效大大取决于所运送的抗原是否具有正确或天然的构象,因为只有正确或天然的构象才能呈现适当的抗原表位，从而诱导特异并有效的免疫反应。因此，错误折迭﹑降解或聚集的抗原都可能降低甚至不能引起特异性的免疫反应。动态光散射法(DynamicLightScattering,DLS)有助于评估蛋白性或病毒性疫苗的完整性和稳定性,从而评估其效力。通过分析DLS图谱，可以检查抗原在一段时间后或在特定缓冲器或温度下存储是否已出现降级或聚集,从而确保疫苗的效力。分离方法例如分子排阻层析法只考虑颗粒的流动性，仅能粗略地估计颗粒的大小,因此不能灵敏地侦测到抗原尺寸上的细微分别。DLS可以灵敏和准确地检测和估计的颗粒的大小，因此可以侦测到颗粒尺寸上的细微差别。然而，DLS只能估计高度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于量化和分析口蹄病病毒的方法，包括以下步骤:a)使用一种或多种酶处理包含口蹄病病毒的原始样本,以获得多个口蹄病病毒样本；b)将第一个口蹄病病毒样本置于一个层析系统内,所述层析系统包括多个泵和多个层析柱，其中i)第一个泵通过第一个阀门连接到第一个层析柱，所述第一个层析柱进一步通过第二个阀门连接到一个检测系统,所述检测系统包含一个动态光散射检测器和一个紫外线检测器；以及ii)第二个泵通过所述第一个阀门连接到第二个层析柱，所述第二个层析柱进一步通过所述第二个阀门连接到废物收集匣,其中当所述第一个口蹄病病毒样本在第一个层析柱中运行时，清洗缓冲液在第二个层析柱中运行；c)从所述第一个层析柱洗脱所述第一个口蹄病病毒样本，并从所述检测系统获得层析图谱，所述层析图谱用于量化及分析所述第一个口蹄病病毒样本；d)切换所述第一个泵和第二个泵的连接,其中i)所述第一个泵通过所述第一个阀门连接到所述第二个层析柱，所述第二个层析柱进一步通过所述第二个阀门连接到所述检测系统；以及ii)所述第二个泵通过所述第一个阀门连接到所述第一个层析柱，所述第一个层析柱进一步通过所述第二个阀门连接到所述废物收集匣；e)将第二个口蹄病病毒样本注入所述第二个层析柱，并将清洗缓冲液注入所述第一个层析柱；f)从所述第二个层析柱洗脱所述第二个口蹄病病毒样本，并从所述检测系统获得层析图谱，所述层析图谱用于量化及分析所述第二个口蹄病病毒样本；以及g)重复步骤(b)至(f)，以量化和分析所述多个口蹄病病毒样本。...

【技术特征摘要】
2014.06.06 US 62/009,1261.一种用于量化和分析口蹄病病毒的方法，包括以下步骤:a)使用一种或多种酶处理包含口蹄病病毒的原始样本,以获得多个口蹄病病毒样本；b)将第一个口蹄病病毒样本置于一个层析系统内,所述层析系统包括多个泵和多个层析柱，其中i)第一个泵通过第一个阀门连接到第一个层析柱，所述第一个层析柱进一步通过第二个阀门连接到一个检测系统,所述检测系统包含一个动态光散射检测器和一个紫外线检测器；以及ii)第二个泵通过所述第一个阀门连接到第二个层析柱，所述第二个层析柱进一步通过所述第二个阀门连接到废物收集匣,其中当所述第一个口蹄病病毒样本在第一个层析柱中运行时，清洗缓冲液在第二个层析柱中运行；c)从所述第一个层析柱洗脱所述第一个口蹄病病毒样本，并从所述检测系统获得层析图谱，所述层析图谱用于量化及分析所述第一个口蹄病病毒样本；d)切换所述第一个泵和第二个泵的连接,其中i)所述第一个泵通过所述第一个阀门连接到所述第二个层析柱，所述第二个层析柱进一步通过所述第二个阀门连接到所述检测系统；以及ii)所述第二个泵通过所述第一个阀门连接到所述第一个层析柱，所述第一个层析柱进一步通过所述第二个阀门连接到所述废物收集匣；e)将第二个口蹄病病毒样本注入所述第二个层析柱，并将清洗缓冲液注入所...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁道夫·塞萨尔·贝林佐尼，尼古拉斯·玛奇，伊曼纽尔·杰拉德·艾蒂安·热古列尔，安娜·罗莫，马塞洛·阿尔诺佛·式必特勒，
申请(专利权)人：杨凌金海生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61