一种高寒区野生老芒麦染色体制片方法技术

本发明专利技术公开了一种高寒区野生老芒麦染色体制片方法，涉及农业技术领域。本发明专利技术方法包括：(1)准备根尖材料；(2)对所述材料进行预处理；(3)对预处理过的材料进行固定、保存，固定时间为18‑24h；(4)对固定后的材料进行解离，室温下解离时间为50‑80min，60℃恒温水浴下解离时间为8‑18min；(5)对解离后的材料进行媒染及染色，染色时间为2‑10h；(6)对染色后的材料进行软化，软化时间为30‑60min；(7)对软化后的材料进行压片；(8)对压片样品进行镜检。本发明专利技术方法操作简单方便，使获得的染色体分散均匀，背景浅，易于观察，得出的染色体数目准确度高。

A Method for Chromosome Production of Wild Old Mangosteen in Alpine Region

【技术实现步骤摘要】
一种高寒区野生老芒麦染色体制片方法
本专利技术涉及农业
，尤其涉及一种高寒区野生老芒麦染色体制片方法。
技术介绍
老芒麦(ElymussibiricusL.)是禾本科小麦族披碱草属多年生疏丛草本植物，是广泛分布于青藏高原高寒区的野生种质资源。老芒麦对该地区极端寒冷干旱的生态环境具有良好的适应性和广泛的生态可塑性，且高产优质，故已成为该地区天然草地改良和人工草地栽培利用的最为广泛的当家牧草草种。在青藏高原同时也分布有大量的垂穗披碱草野生种质资源。老芒麦和垂穗披碱草皆为花序下垂类披碱草属物种，由于形态学特征受到生长环境的长期影响，对二者进行准确的区分比较困难。老芒麦和垂穗披碱草在长期适应进化过程中，两个种不同的生态型在形态性状上具有较多的性状交叉，使得分类学的鉴定很困难，甚至会造成许多学者对形态学性状相似的不同种的错误鉴定。据报道，垂穗披碱草(E.nutansGriseb.)的染色体数目为2n＝6x＝42，属于六倍体，染色体组为StStHHYY，而老芒麦的染色体数目为2n＝4x＝28，属于四倍体，染色体组为StStHH。在以往的研究中发现，老芒麦除了具有典型的整倍体细胞外，还有一些非整倍体细胞出现。这些细胞学染色体数目上的变异，是植物形态学特征分化的基础。很多研究报道，老芒麦和垂穗披碱草在形态学特征上存在着性状交叉，有必要将难以鉴别的种质材料进行染色体数和核型的分析，作为形态学鉴定的补充和证据，并通过核型分析为育种家利用一些特异性种质材料提供更为详实可靠的数据。孙义凯等研究报道老芒麦核型公式为20+8sm(4SAT)，王琴等报道的老芒麦核型公式为2n＝4x＝28＝24m(2AST)+4sm,陈仕勇等研究提出老芒麦的核型公式为2n＝4x＝28＝22m+6sm(2SAT)。Dewey研究表明，老芒麦是具有两个名为S和H的染色体组的四倍体，2n＝28，其染色体组成为StStHH。前人对老芒麦染色体研究结果存在结果不统一，争议性较大，且染色体制片方法也不尽相同。青藏高原分布的野生老芒麦，长期生长在海拔较高的高寒环境中，形态及结构都与其他老芒麦有明显的不同。本专利技术人在研究老芒麦染色体时发现现有技术中的固定、解离、染色及软化时间等方法，无法清晰观察到染色体形态及数目。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术实施例提供了一种高寒区野生老芒麦染色体制片方法，主要目的是解决现有染色体制片方法无法清晰观察到染色体形态及数目的问题。为达到上述目的，本专利技术主要提供了如下技术方案：一方面，本专利技术实施例提供了一种高寒区野生老芒麦染色体制片方法，所述方法包括以下步骤：(1)准备根尖材料；(2)对所述材料进行预处理；(3)对预处理过的材料进行固定、保存，固定时间为18-24h；(4)对固定后的材料进行解离，室温下解离时间为50-80min，60℃恒温水浴下解离时间为8-18min；(5)对解离后的材料进行媒染及染色，染色时间为2-10h；(6)对染色后的材料进行软化，软化时间为30-60min；(7)对软化后的材料进行压片；(8)对压片样品进行镜检。作为优选，所述固定时间为22-24h。作为优选，所述室温下解离时间为70-80min；所述60℃恒温水浴下解离时间为12-15min。作为优选，所述染色时间为5-7h。作为优选，所述软化时间为40-45min。作为优选，所述固定时间为24h；所述60℃恒温水浴下解离时间为12min。作为优选，所述染色时间为6h；所述软化时间为40min。作为优选，所述步骤(1)具体操作包括：挑选颗粒饱满大小均一的野生老芒麦种子，用浓度1％的高锰酸钾溶液消毒5～10min，用蒸馏水冲洗5～6次，置于垫有湿滤纸的培养皿中，放置于25℃的恒温箱内发芽；所述步骤(2)具体操作包括：待根长1～1.5cm，挑选粗壮的根尖，剪取0.5cm左右，浸入浓度为2mmol/L的8-羟基喹啉溶液中，放到暗处预处理时间2h，4h，处理时间2h，4h；4h处理时，分为直接处理4h和期间每两小时更换一次溶液。作为优选，所述步骤(3)具体操作包括：将预处理过的幼根根尖用蒸馏水冲洗3～5次，放入卡诺液，即无水乙醇：冰乙酸＝3：1中，固定18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h；将固定后的根尖用蒸馏水彻底清洗干净，然后放入70％酒精中，于4℃冰箱中保存备用；所述步骤(4)具体操作包括：将固定完或保存于酒精中的幼根用蒸馏水彻底清洗干净后将其放入1mol/LHCl中；在室温下解离，解离时间为50min、60min、70min、80min；在60℃下恒温水浴条件下解离，解离时间为8min、10min、12min、14min、16min、18min；所述步骤(5)具体操作包括：将解离完的幼根用蒸馏水清洗干净，再用4％硫酸铁铵水溶液媒染4h后，将媒染后的幼根用蒸馏水冲洗干净后，用0.5％苏木精水溶液染色2h、4h、6h、8h、10h。作为优选，所述步骤(6)具体操作包括：将染好色的幼根用蒸馏水清洗干净后置于45％冰醋酸中软化30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min；所述步骤(7)具体操作包括：在洁净的载玻片上切取根尖1mm左右，加一滴45％乙酸，盖上盖玻片；取两张滤纸对折，将放有根尖的载玻片放置其中，用橡皮轻敲盖玻片，使根尖细胞散开，用拇指挤压盖玻片，使其在载玻片上呈现雾状，而后放置在显微镜下观察；所述步骤(8)具体操作包括：将载玻片放置在载物台上，然后先在10倍镜下找分散较好的细胞并移入视野中央，接着换40倍镜下寻找清晰地处于细胞分裂中期的图像进行观察，观察根尖所有的视野，以染色体的清晰程度、分散及聚缩程度等作为判断染色体效果观察图的标准。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术针对现有染色体制片技术无法清晰观察到染色体形态及数目的技术问题，通过多年研究发现一种操作简单方便的高寒区野生老芒麦染色体的制片方法，使获得的染色体分散均匀，背景浅，易于观察，得出的染色体数目准确度高。附图说明图1是本专利技术实施例1提供的预处理4h+染色6h的显微镜图；图2是本专利技术实施例1提供的预处理4h(期间更换一次溶液)+染色6h显微镜图；图3是本专利技术实施例1提供的染色6h+60℃恒温水浴下解离10min显微镜图；图4是本专利技术实施例1提供的染色6h+60℃恒温水浴下解离12min显微镜图；图5是本专利技术实施例1提供的染色8h+60℃恒温水浴12min显微镜图；图6是本专利技术实施例1提供的媒染4h+苏木精染色6h+60℃恒温水浴12min+软化40min显微镜图。具体实施方式为更进一步阐述本专利技术为达成预定专利技术目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本专利技术申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。实施例1一种高寒区野生老芒麦染色体制片方法，包括以下步骤：试验试剂：0.002M8-羟基喹啉、卡诺氏固定液(无水乙醇：冰醋酸＝3:1)、1mol/LHCl、4％硫酸铁铵水溶液、0.5％苏木精水溶液、45％冰醋酸水溶液。试验方法：主要采用植物根尖压片法，染色方法为铁矾—苏木精(NH4Fe(S04)2—C16H14O6)染色法。准备根尖材本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高寒区野生老芒麦染色体制片方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)准备根尖材料；(2)对所述材料进行预处理；(3)对预处理过的材料进行固定、保存，固定时间为18‑24h；(4)对固定后的材料进行解离，室温下解离时间为50‑80min，60℃恒温水浴下解离时间为8‑18min；(5)对解离后的材料进行媒染及染色，染色时间为2‑10h；(6)对染色后的材料进行软化，软化时间为30‑60min；(7)对软化后的材料进行压片；(8)对压片样品进行镜检。

【技术特征摘要】
1.一种高寒区野生老芒麦染色体制片方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)准备根尖材料；(2)对所述材料进行预处理；(3)对预处理过的材料进行固定、保存，固定时间为18-24h；(4)对固定后的材料进行解离，室温下解离时间为50-80min，60℃恒温水浴下解离时间为8-18min；(5)对解离后的材料进行媒染及染色，染色时间为2-10h；(6)对染色后的材料进行软化，软化时间为30-60min；(7)对软化后的材料进行压片；(8)对压片样品进行镜检。2.如权利要求1所述的一种高寒区野生老芒麦染色体制片方法，其特征在于，所述固定时间为22-24h。3.如权利要求1所述的一种高寒区野生老芒麦染色体制片方法，其特征在于，所述室温下解离时间为70-80min；所述60℃恒温水浴下解离时间为12-15min。4.如权利要求1所述的一种高寒区野生老芒麦染色体制片方法，其特征在于，所述染色时间为5-7h。5.如权利要求1所述的一种高寒区野生老芒麦染色体制片方法，其特征在于，所述软化时间为40-45min。6.如权利要求1所述的一种高寒区野生老芒麦染色体制片方法，其特征在于，所述固定时间为24h；所述60℃恒温水浴下解离时间为12min。7.如权利要求1所述的一种高寒区野生老芒麦染色体制片方法，其特征在于，所述染色时间为6h；所述软化时间为40min。8.如权利要求1所述的一种高寒区野生老芒麦染色体制片方法，其特征在于，所述步骤(1)具体操作包括：挑选颗粒饱满大小均一的野生老芒麦种子，用浓度1％的高锰酸钾溶液消毒5～10min，用蒸馏水冲洗5～6次，置于垫有湿滤纸的培养皿中，放置于25℃的恒温箱内发芽；所述步骤(2)具体操作包括：待根长1～1.5cm，挑选粗壮的根尖，剪取0.5cm左右，浸入浓度为2mmol/L的8-羟基喹啉溶液中，放到暗处预处理时间2h，4h，处理时间2...

【专利技术属性】
技术研发人员：祁娟，师尚礼，焦婷，刘黎，陈建纲，方强恩，刘欢，刘艳君，吴召林，金鑫，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62