一种快速鉴别非洲猪瘟病毒的检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及一种快速鉴别非洲猪瘟病毒核酸的检测试剂盒及其检测方法，属生物技术领域，本发明专利技术筛选出1对特异性高、敏感性强的RPA引物和能强烈激活CRISPR‑Cas12a切割酶活性的cr RNA靶点序列，通过RPA技术联合CRISPR‑Cas12a特异性切割方法建立了一种即时快速的准确鉴别非洲猪瘟病毒核酸的方法，该方法对实验条件和检测仪器设备要求不高，室温条件即可完成检测过程，另外该方法检测速度快，温育半小时内即可以靶向切割分子探针释放荧光信号，检测结果更加精准可靠，适合进一步推广应用。

A Kit for Rapid Identification of African Swine Fever Virus and Its Detection Method

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴别非洲猪瘟病毒的检测试剂盒及其检测方法
本专利技术属于分子生物检测
，尤其涉及一种检测试剂盒及检测方法，具体涉及是一种快速鉴别非洲猪瘟病毒核酸的检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)引起的一种高烈性、高度接触性动物传染病，猪一旦感染之后死亡率可达到100％，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病，我国也将非洲猪瘟列为一类动物疫病。近年来，中国周边国家格鲁吉亚、亚美尼亚、阿塞拜疆、俄罗斯、乌克兰等国先后发生多起非洲猪瘟疫情，自2018年8月辽宁省沈阳市首例非洲猪瘟疫情确诊以来，全国多个省市都相继报告非洲猪瘟疫病例。截至2018年10月29日，全球有37个国家和地区向OIE报告发生非洲猪瘟疫情。特别是2018年以来，波兰、俄罗斯、拉脱维亚、捷克、罗马尼亚、摩尔多瓦、乌克兰、匈牙利、保加利亚、比利时、科特迪瓦、南非、乍得、赞比亚和中国等15个国家共计发生了4183起非洲猪瘟疫情。由于目前世界上还没有研发出有效的针对非洲猪瘟的疫苗，为防止疾病传播疫点内的生猪只能被全部扑杀和无害化处理，给养殖业带来巨大经济损失。因此，在当前严峻的防控形势下研发简便、快速、精确的非洲猪瘟现场检测技术就显得非常迫切。非洲猪瘟病毒属于非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)，是一种有囊膜的双链DNA病毒，能够耐受低温环境，4℃可以存活1年，在冷冻猪肉中可以存活数年之久；但是非洲猪瘟病毒对高温比较敏感，25-37℃可以存活数周，56℃大约可以存活70分钟，而60℃则仅可存活20分钟。乙醚、氯仿、2％氢氧化钠、3％次氯酸钠和0.3％福尔马林等多种消毒剂均可有效杀灭非洲猪瘟病毒。非洲猪瘟病毒粒子主要由病毒基因组(Genome)、核心壳(Coreshell)、内膜(Innerenvelope)、衣壳(Capsid)和囊膜(Externalenvelope)组成，外形似正六边形，直径约200nm。非洲猪瘟病毒基因组不具有感染性，复制主要发生在胞浆，但有一个短暂的入核过程，对病毒的复制起始有着重要作用，因此非洲猪瘟病复制机制与痘病毒比较相似。非洲猪瘟病毒基因组为双链闭合线性DNA分子，大小约为170–194kb，含有150–160个开放阅读框(ORF)，总共编码54种结构蛋白和100多种非结构蛋白。非洲猪瘟病毒基因组主要由末端的发卡环结构、中间部分是比较稳定的基因区和由串联重复序列和多基因家族构成的可变区三部分组成，其中可变区基因拷贝数的变化是造成基因组大小不等的主要因素。根据编码主要衣壳蛋白的p72(B646L)基因末端约500bp核苷酸的差异已鉴定出24种基因型，但是基因型不能反映出病毒血清学特性，也不能反映毒株的免疫学特。利用PCR技术对不同病毒基因型进行遗传演化分析发现，西非地区流行的主要是基因Ⅰ型，东非和南非则有20多种基因型。基因II型流行于非洲东南部，2007年传至格鲁吉亚、俄罗斯和东欧地区；2017年该基因型病毒传播至俄罗斯伊尔库茨克地区。目前我国流行的毒株为基因II型，与俄罗斯及东欧流行的毒株属同一分支。原核生物(如细菌和古细菌等)通过CRISPR和CRISPR相关(Cas)蛋白介导适应性免疫，CRISPR-Cas系统的发现引起基因编辑
发生了革命性突破。特别是CRISPR-Cas9迅速风靡全球，与之类似的CRISPR-Cas12a(最初称为Cpf1)被发现也可以用于切割目标DNA，而且研究发现Cas12a能够在Cas9不能作用的位置切割双链DNA，留下的不规则边缘使得插入新基因更加容易。最特别的是，Cas12a在切割目标双链DNA后会对所有的单链DNA进行任意切割，根据Cas12a对单链DNA可以进行“任意切割”的这种特性可以开发出对细胞、血液、唾液、尿液和粪便等样本中病毒DNA进行快速、准确检测的检测系统。由于当前非洲猪瘟防控形势非常严峻，开发新型的猪瘟病毒检测工具必须确保具有较高的灵敏度和较强的特异性，并且还要能够在条件简陋的现场检测环境下实现快速准确报告结果。
技术实现思路
针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一款快速准确鉴别非洲猪瘟病毒的检测试剂盒及其检测方法，通过本专利技术制备的检测试剂盒能够在常温条件下对样本进行RPA等温扩增迅速增加病毒的拷贝数，通过CRISPR-Cas12a和crRNA结合后靶向切割病毒核酸并且进一步切割荧光淬灭分子探针的单链DNA产生荧光信号，因此在仪器设备简单、常温下的现场检测中即可快速准确的鉴别非洲猪瘟病毒。本专利技术通过下述技术方案实现上述技术效果：一种用于快速鉴别非洲猪瘟病毒核酸的基因序列，其核苷酸序列如SEQ.NO.1所示。该基因序列根据美国国立生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI)数据库检索到ASFV-SY18毒株的p72(B646L)基因的核苷酸序列(GenBank:MH713612.1)合成长度为1941bp的基因片段。该序列能强烈激活CRISPR-Cas12a切割酶活性。本专利技术还提供了一种快速鉴别非洲猪瘟病毒核酸的方法，其包括如下步骤：1)根据编码非洲猪瘟病毒主要衣壳蛋白的p72(B646L)基因的核苷酸序列设计一对特异性引物，利用重组酶聚合酶扩增(RPA)体系对样本非洲猪瘟病毒核酸进行等温扩增以增加非洲猪瘟病毒核酸的拷贝数；2)通过体外重组表达的方法获得CRISPR-Cas12a酶，根据非洲猪瘟病毒p72(B646L)基因序列设计切割靶点，构建能够特异性切割非洲猪瘟病毒核酸的向导RNA，通过CRISPR-Cas12a酶、向导RNA与非洲猪瘟病毒共同形成的反应体系激活CRISPR-Cas12a酶的切割活性；3)构建一种包含荧光基团和淬灭基团的单链DNA分子探针，被激活的Cas12a酶通过切割分子探针的单链DNA产生荧光信号，从而即时、准确的鉴别检测非洲猪瘟病毒核酸。优选地，制备非洲猪瘟病毒核酸标准品的步骤中，所述的核苷酸序列是根据美国国立生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI)数据库检索到ASFV-SY18毒株的p72(B646L)基因的核苷酸序列(GenBank:MH713612.1)合成长度为1941bp的基因片段，将其克隆到pGEM-T载体上，经测序验证后转化大肠杆菌扩增，采用质粒提取试剂盒提取重组质粒后，测定浓度为265.8ng/μL，作为重组酶聚合酶扩增(RPA)模板的标准品(换算成拷贝数为8.9×1010Copy/μL)。在建立重组酶聚合酶扩增(RPA)反应的体系时，首先使用Primer5软件设计特异性的扩增引物和相应的荧光分子探针。优选地，所述的特异性引物中正向引物为P1，其序列如SEQ.NO.6所示，反向引物为P2：其序列如SEQ.NO.7所示。所述的荧光分子探针的序列为5'-SEQ.NO.8[FAM]C[THF]T[BHQ]SEQ.NO.9-3'。优选地，50μL重组酶聚合酶扩增(RPA)反应体系包括如下体积的组分：正向引物2.1μL，反向引物2.1μL，荧本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于快速鉴别非洲猪瘟病毒核酸的基因序列，其核苷酸序列如SEQ.NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于快速鉴别非洲猪瘟病毒核酸的基因序列，其核苷酸序列如SEQ.NO.1所示。2.一种快速鉴别非洲猪瘟病毒核酸的方法，其包括如下步骤：1)根据编码非洲猪瘟病毒主要衣壳蛋白的p72基因的核苷酸序列设计一对特异性引物，利用重组酶聚合酶扩增体系对样本非洲猪瘟病毒核酸进行等温扩增以增加非洲猪瘟病毒核酸的拷贝数；2)通过体外重组表达的方法获得CRISPR-Cas12a酶，根据非洲猪瘟病毒p72基因序列设计切割靶点，构建能够特异性切割非洲猪瘟病毒核酸的向导RNA，通过CRISPR-Cas12a酶、向导RNA与非洲猪瘟病毒核酸共同形成的反应体系激活CRISPR-Cas12a酶的切割活性；3)构建一种包含荧光基团和淬灭基团的单链DNA分子探针，被激活的Cas12a酶通过切割分子探针的单链DNA产生荧光信号，从而即时、准确的鉴别检测非洲猪瘟病毒核酸。3.根据权利要求2所述的快速鉴别非洲猪瘟病毒核酸的方法，其特征在于，所述步骤1)包括下述步骤：合成长度为1941bp的基因片段，将其克隆到pGEM-T载体上，经测序验证后转化大肠杆菌扩增，采用质粒提取试剂盒提取重组质粒后，测定浓度为265.8ng/μL，作为重组酶聚合酶扩增模板的标准品。4.根据权利要求2所述的快速鉴别非洲猪瘟病毒核酸的方法，其特征在于，步骤1)中所述的特异性引物中正向引物为P1，其序列如SEQ.NO.6所示，反向引物为P2，其序列如SEQ.NO.7所示，所述的荧光分子探针的序列为5'-SEQ.NO.8[FAM]C[THF]T[BHQ]SEQ.NO.9-3'，所述步骤3)中单链DNA分子探针序列为5'-[FAM]SEQ.NO.2[TAMRA]-3'。5.根据权利要求2所述的快速鉴别非洲猪瘟病毒核酸的方法，其特征在于，步骤1)中50μL重组酶聚合酶扩增(RPA)反应体系包括如下体积的组分：正向引物2.1μL，反向引物2.1μL，荧光分子探针0.6μL，无引物水合缓冲液29.5μL，模板标准品10μL，分子级双蒸水3.2μL和醋酸镁2.5μL；步骤2)中20μLCRISPR-Cas12a蛋白酶：crRNA体外切割体系时具体包括如下体积的组分：2.88μLCRISPR-Cas12a蛋白酶，1.6μLcrRNA，2μLNEBbuffer3，1μL荧光淬灭探针，12...

【专利技术属性】
技术研发人员：马志永，魏建超，李宗杰，狄荻，谷峰，张俊杰，欧安妮，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心，
类型：发明
国别省市：上海,31