检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法。该引物组包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1～5所示的引物组；试剂盒包括上述的引物组、反应试剂；该试剂盒的使用方法如下：首先配制LAMP反应体系；恒温反应所得产物直接进行肉眼判读：阳性结果为黄色，阴性结果为红色。本发明专利技术提供的试剂盒操作简单、成本低廉，反应快速，特异性好，结果易于观察，非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧养殖场的现场检测，易于大范围推广应用。

LAMP primers, kits and detection methods for detection of African swine fever virus

【技术实现步骤摘要】
检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法
本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)感染引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告的动物疫病，中国将其列为一类动物疫病。非洲猪瘟对人不致病，不属于人畜共患病，但猪感染后发病率和病死率可高达100％。目前，ASF的实验室检测方法主要包括间接免疫荧光试验、ELISA、PCR等。间接免疫荧光试验虽属标准检测方法，但操作繁琐，很难在条件一般的实验室开展，因此目前的检测仍以PCR等常规分子生物学方法为主。然而，这些常规分子生物学方法大多需要与电泳、荧光或测序等技术结合，且以大型仪器和熟练专业技能的操作人员为前提，无法满足兽医基层或现场的快速检测需要。环等温扩增是一种核酸扩增新技术，其特点是仅需针对靶基因6个区域的特异引物，在恒温条件即可完成扩增，不需热变性、热循环等过程。为了方便结果判别，通常在LAMP反应体系中加入金属离子指示剂，如钙黄绿素(黄绿色-橙红色)、羟基萘酚蓝(蓝紫色-天蓝色)等，通过反应管的颜色变化观察结果。但遗憾的是，目前这些颜色变化之间色差不大，且通常需要较长的反应时间(60min)。专利《一种检测非洲猪瘟病毒环介导等温的扩增方法》(申请号：201610023649.4，申请日：2016-01-14；公开号：CN105463135A，公开日：2016-04-06)将LAMP技术应用于非洲猪瘟病毒的检测，但该方法需在反应后开盖加入SYBRGreenI进行结果判别，容易产生气溶胶污染。专利《一种针对非洲猪瘟病毒的核酸快速检测方法》(申请号：201811085469.4，申请日：2018-09-18；公开号：CN109295255A，公开日：2019.02.01)将LAMP技术应用于非洲猪瘟病毒的检测，但该方法需借助仪器进行结果判别。专利《一种用于非洲猪瘟病毒LAMP检测的引物组、试剂盒及应用》(申请号：201910036166.1，申请日：2019.01.15；公开号：CN109628644A，公开日：2019.04.16)将LAMP技术应用于非洲猪瘟病毒的检测，但该方法需在反应体系中额外添加MnCl2进行结果判别。已有研究表明，在LAMP反应体系中额外添加MnCl2会降低反应的特异性。
技术实现思路
本专利技术的目的首先是提供了一种非洲猪瘟病毒的LAMP引物组，其次是提供该LAMP快速检测试剂盒，再次是提供该试剂盒的检测方法。当DNA聚合酶将一个脱氧核糖核苷酸分子结合到新合成的DNA双链上时，会生成一个氢离子作为副产物，随着反应的进行会产生大量的氢离子，氢离子浓度的增加会使得反应体系的pH值降低。基于LAMP反应的这个特性，我们通过调整LMAP反应体系的缓冲液成分，并在反应体系中添加PH指示剂，在不改变原有LAMP反应体系基本组成的基础上，建立了新型比色法LMAP检测技术。针对兽医诊断领域缺乏可用于现场使用的ASFV快速检测方法这一问题，我们进一步通过设计和筛选针对ASFVP72基因的引物组，组装了ASFV比色法LAMP快速检测试剂盒。为达到上述目的，本专利技术采取的具体技术方案为：一种检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组，由外引物F3和外引物B3、内引物FIP和内引物BIP、环引物LoopB组成；所述外引物F3的核苷酸序列为：5’-ACATGTCCGAACTTGTGC-3’；所述外引物B3的核苷酸序列为：5’-TGTAACCCCTGAAATACACA-3’；所述内引物FIP的核苷酸序列为：5’-GTCTGCTCTTAAATGGCCCATTG-GATGAGGATTTTGATCGGAGAT-3’；所述内引物BIP的核苷酸序列为：5’-AGTTTTTCATCGTGGTGGTTATTGT-TGTAAAACGCGTTCGCTT-3’；所述环引物LoopB的核苷酸序列为：5’-CCTGCGTTTTATGGACACGTA-3’。一种检测非洲猪瘟病毒的LAMP试剂盒，包括上述的检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物预混液，其中外引物F3终浓度为0.2mmol/L；外引物B3终浓度为0.2mmol/L；内引物FIP终浓度为1.6mmol/L；内引物BIP终浓度为1.6mmol/L；环引物LoopB终浓度为0.4mmol/L。进一步地，该试剂盒还包括LAMP反应预混液(2×)，其中(NH4)2SO4终浓度为10mmol/L；KCl终浓度为50mmol/L；Tween-20终浓度为0.1％；甲酚红终浓度为0.12mmol/L；KOH终浓度为4mmol/L；dNTP终浓度为0.8mmol/L；BstWarmStartTMDNA聚合酶终浓度为0.32U/μL；MgSO4终浓度为6mM。上述的引物组或试剂盒在检测待测样品是否感染非洲猪瘟病毒中的应用。一种检测待测样品是否感染非洲猪瘟病毒/使用上述引物组或试剂盒的检测方法，包括以下步骤：4)使用所述的引物组配置引物混合液，其中外引物F3终浓度为0.2mmol/L；外引物B3终浓度为0.2mmol/L；内引物FIP终浓度为1.6mmol/L；内引物BIP终浓度为1.6mmol/L；环引物LoopB终浓度为0.4mmol/L。5)配置LAMP反应预混液(2×)，其中(NH4)2SO4终浓度为10mmol/L；KCl终浓度为50mmol/L；Tween-20终浓度为0.1％；甲酚红终浓度为0.12mmol/L；KOH终浓度为4mmol/L；dNTP终浓度为0.8mmol/L；BstWarmStartTMDNA聚合酶终浓度为0.32U/μL；MgSO4终浓度为6mM。6)使用引物混合液和LAMP反应预混液(2×)对待测样品进行LAMP扩增，得到扩增产物；反应体系为25μL，其中引物混合液6.5μL，LAMP反应预混液(2×)10μL，待测样品DNA2.0μL，DNasefreewater4.0μL。4)结果判读：直接肉眼判读，a)阴性：若扩增产物呈现红色，证明待测样品没有非洲猪瘟病毒感染；b)阳性：若扩增产物呈现黄色，证明待测样品为非洲猪瘟病毒感染。进一步地，步骤6)中反应条件包括：恒温反应的时间为40min；恒温反应的温度为64℃。与现有技术相比，本专利技术的优点和有益效果：1)由于LAMP检测方法成本低廉，在64℃实现等温扩增，不需要复杂且昂贵的PCR仪，因此本专利技术提供的试剂盒使用成本低。2)本专利技术所提供的试剂盒反应迅速，可以在40min内完成反应。3)本专利技术提供的试剂盒得到的反应结果直观准确，通过肉眼观察颜色直接进行判定，无需进行复杂操作。4)本专利技术提供的试剂盒特异性好，对猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪肾上皮细胞传代系PK-15、猪丹毒杆菌、副猪嗜血杆菌血清5型、猪链球菌血清2型的基因组DNA都呈阴性反应；敏度性高，最低可以检测到470拷贝的非洲猪瘟病毒P72基因。5)本专利技术提供的LAMP检测试剂盒可快速、敏感的检测非洲猪瘟病毒，该试剂盒操作简单、成本低廉、反应快速、结果易于观察，特异性好，非常适用于出本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组，其特征在于，该LAMP引物组由外引物F3和外引物B3、内引物FIP和内引物BIP、环引物LoopB组成；所述外引物F3的核苷酸序列为：5’‑ACATGTCCGAACTTGTGC‑3’；所述外引物B3的核苷酸序列为：5’‑TGTAACCCCTGAAATACACA‑3’；所述内引物FIP的核苷酸序列为：5’‑GTCTGCTCTTAAATGGCCCATTG‑GATGAGGATTTTGATCGGAGAT‑3’；所述内引物BIP的核苷酸序列为：5’‑AGTTTTTCATCGTGGTGGTTATTGT‑TGTAAAACGCGTTCGCTT‑3’；所述环引物LoopB的核苷酸序列为：5’‑CCTGCGTTTTATGGACACGTA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组，其特征在于，该LAMP引物组由外引物F3和外引物B3、内引物FIP和内引物BIP、环引物LoopB组成；所述外引物F3的核苷酸序列为：5’-ACATGTCCGAACTTGTGC-3’；所述外引物B3的核苷酸序列为：5’-TGTAACCCCTGAAATACACA-3’；所述内引物FIP的核苷酸序列为：5’-GTCTGCTCTTAAATGGCCCATTG-GATGAGGATTTTGATCGGAGAT-3’；所述内引物BIP的核苷酸序列为：5’-AGTTTTTCATCGTGGTGGTTATTGT-TGTAAAACGCGTTCGCTT-3’；所述环引物LoopB的核苷酸序列为：5’-CCTGCGTTTTATGGACACGTA-3’。2.一种检测非洲猪瘟病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的的检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物预混液，其中外引物F3终浓度为0.2mmol/L；外引物B3终浓度为0.2mmol/L；内引物FIP终浓度为1.6mmol/L；内引物BIP终浓度为1.6mmol/L；环引物LoopB终浓度为0.4mmol/L。3.如权利要求2所述的LAMP试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括LAMP反应预混液，其中(NH4)2SO4终浓度为10mmol/L；KCl终浓度为50mmol/L；Tween-20终浓度为0.1％；甲酚红终浓度为0.12mmol/L；KOH终浓度为4mmol/L；dNTP终浓度为0.8mmol/L；BstWarmStartTMDNA聚合酶终...

【专利技术属性】
技术研发人员：勾红潮，李春玲，蔡汝健，楚品品，宋帅，蒋智勇，李艳，杨冬霞，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物卫生研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44