一种利用多重PCR技术检测三种马铃薯病原菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用多重PCR技术检测马铃薯上三种病原菌的方法，属于生物检测技术领域。该方法采用多重PCR一次性同时扩增致病疫霉、茄链格孢菌和立枯丝核菌AG3融合群三种病原菌的特异基因，再通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。包括如下步骤：（1）提取三种病原菌的基因组DNA；（2）分别设计三对扩增引物；（3）进行多重PCR反应；（4）电泳检测。本方法采用多重PCR技术同时检测三种病原菌，具有高效、快速、节约时间、降低成本的优点。

A Method for Detecting Three Potato Pathogens by Multiplex PCR

【技术实现步骤摘要】
一种利用多重PCR技术检测三种马铃薯病原菌的方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种利用多重PCR技术检测三种马铃薯病原菌的方法。
技术介绍
马铃薯(SolanumtuberosumL.)是粮、菜、饲、加工兼用型作物，其具有生产周期短、适应范围广、产量高和营养丰富等特点，因而在世界范围内被广泛种植。我国是世界上最大的马铃薯生产国，主要的种植区分布在华北、东北、西南和南方等地区。马铃薯的块茎含有丰富的淀粉、蛋白质、抗氧化物和维生素，具有粮食、蔬菜、饲料兼用的特点，加工方式多种多样，在增加食品营养源、保障粮食安全和促进经济发展方面具有重要的保障作用。在农业资源过度开发、耕地地力下降、水资源更为紧缺的背景下，我国正启动马铃薯主粮化战略，推进把马铃薯加工成馒头、面条、米粉等主食，此举开辟了保障国家粮食安全的新途径，也有利于缓解资源环境压力，实现农业可持续发展。因此，国家高度重视马铃薯产业发展，不断加大政策扶持力度，科技投入也不断增加，促进中国马铃薯产业持续、稳定、健康地发展。然而，随着种植面积的不断扩大，病害成为限制马铃薯高产丰收的主要原因，严重影响了马铃薯的收益。马铃薯易受晚疫病、早疫病、黑痣病、青枯病和炭疽病等多种病害的危害，导致马铃薯的产量减少和质量下降。马铃薯晚疫病是致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起的，是一种能造成马铃薯茎叶死亡和块茎腐烂从而导致马铃薯减产的毁灭性病害，病情较轻时减产10%-20%，病情严重流行时可达到50%-70%。马铃薯晚疫病自20世纪50年代初在我国广泛大流行以来已经成为危害马铃薯的主要病害和主要减产因素。马铃薯早疫病是由茄链格孢(Alternariasolani)引起的仅次于晚疫病的第二大病害。近年来，早疫病在许多马铃薯产区频繁发生并有上升趋势，一般年份可造成马铃薯减产5%-10%，病害严重年份产量减产可达50%以上。马铃薯黑痣病是由立枯丝核菌（RhizoctoniasolaniKühn）引起的以带病种薯和土壤传播的病害，一般田块黑痣病的发病率在5％-10％，而重症田块可达到70%-80％。根据同工酶谱、致病性、DNA碱基同源性和培养性状等特性，可将立枯丝核菌划分为14个融合群，分别命名为AG1-AG13和AG-BI，侵染马铃薯的主要为AG3融合群。目前防治这些马铃薯病害的策略主要包括抗病品种和化学防治。抗病育种虽然取得了一定的防治效果，但抗性很容易被病原菌克服，因此之前推广的一些品种已不具抗病性。化学防治同样存在问题，不但对环境造成了污染，而且病原菌容易对药剂产生抗药性，导致防治效果明显降低。因此，采取一些措施来防止病害的发生就显得尤为重要，比如在马铃薯播种前对种薯或者土壤进行病原菌的检测。此外，当病害发生以后，准确、快速地鉴定和检测病原菌是进行病害诊断以及有效的病害防治的重要基础。综上所述，发展快速、灵敏、特异、安全的检测马铃薯病原菌的方法对马铃薯的安全生产具有重要意义。传统的病原菌检测方法因需要借助显微镜、分离培养、生物测定、血清学等技术这些手段而具有步骤繁琐、耗时长以及检测结果不准确等缺点。此外，在田间，病害往往是由多种病原菌混合侵染导致的，这增加了检测的复杂度，此时常规的分离鉴定方法更加不能满足检测需求。分子生物学的飞速发展，为病原菌的快速、准确鉴定提供了可靠的技术支持。目前最常用的植物病原菌检测技术是聚合酶链式反应（PCR）。PCR具有快速、高效、灵敏和特异等优点，被广泛应用于检测各种病原菌，如真菌、细菌和病毒。PCR方法建立以后，衍生出了多种以PCR为基础的检测技术，包括多重PCR、real-timePCR、RT-PCR、巢式PCR、固相PCR等。多重PCR是在一个反应体系中同时扩增多个目的基因片段的PCR技术。多重PC技术具有节省时间、降低成本和提高效率的优势，已经成为生命科学各个领域中的重要的研究手段。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的缺点与不足，提供一种利用多重PCR技术检测三种马铃薯病原菌的方法。该方法快速、灵敏、准确、操作简便。本专利技术的目的，通过下述技术方案实现：一种利用多重PCR技术检测三种马铃薯病原菌的方法，其特征在于，采用多重PCR一次性同时扩增致病疫霉（Phytophthorainfestans）、茄链格孢菌（Alternariasolani）和立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani）AG3融合群三种病原菌的特异基因，再通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。一种利用多重PCR技术检测三种马铃薯病原菌的方法，包括以下步骤：（1）模板的准备：分别提取致病疫霉、茄链格孢菌和立枯丝核菌AG3融合群三种马铃薯病原菌的DNA。（2）设计扩增引物：根据GenBank中已经发表的三种马铃薯病原菌的特异基因序列，分别设计并合成用于扩增三种马铃薯病原菌特异基因的引物。（3）多重PCR反应：将步骤（1）制备的模板、步骤（2）设计合成的引物进行多重PCR反应。（4）琼脂糖凝胶电泳检测：对多重PCR反应的产物进行电泳，根据电泳图中目的条带的有无和目的条带的大小来判断样品中是否含有一种或多种病原菌。步骤（2）中所述马铃薯病原菌特异基因序列优选为致病疫霉的INF1基因、茄链格孢菌的histoneH3基因和立枯丝核菌（AG3融合群）的RSENDO1基因。所述步骤（2）中三种病原菌特异基因的引物分别为：设计合成的致病疫霉的INF1基因的引物为Pi-F和Pi-R，其核苷酸序列为：上游引物Pi-F:5’-TTGTGAAGGCGTCATTCC-3’；下游引物Pi-R:5’-CCGAGAGGATGCTTACGA-3’；该引物扩增获得的目的基因产物为401bp；设计合成的茄链格孢菌的histoneH3基因的引物为As-F和As-R，其核苷酸序列为：上游引物As-F：5’-TCACCTCACTCTGCGATG-3’；下游引物As-R：5’-GAAGACTGGAAGCGGAGA-3’；该引物扩增获得的目的基因产物为209bp；设计合成的立枯丝核菌（AG3融合群）RSENDO1基因的引物为Rs-F和Rs-R，其核苷酸序列为：上游引物Rs-F：5’-TCAGCAGGAGAACACAGT-3’；下游引物Rs-R：5’-CTTCACAAGACCGAACCA-3’；该引物扩增获得的目的基因产物为307bp；步骤（3）中所述多重PCR反应的体系包含：三种病原菌模板DNA、致病疫霉上下游引物、茄链格孢菌上下游引物、立枯丝核菌（AG3融合群）上下游引物、聚合酶、聚合酶缓冲液、dNTPs和ddH2O；所述的三种病原菌模板DNA为致病疫霉DNA、茄链格孢菌DNA和立枯丝核菌（AG3融合群）DNA；所述的致病疫霉上下游引物的终浓度为160nM；所述的茄链格孢菌上下游引物的终浓度为240nM；所述的立枯丝核菌（AG3融合群）上下游引物的终浓度为240nM。步骤（3）所述多重PCR反应的条件优选为：三种病原菌的模板DNA各1ng/μL、致病疫霉上下游引物（Pi-F和Pi-R）各160nM，茄链格孢菌上下游引物（As-F和As-R）各240nM、立枯丝核菌（AG3融合群）上下游引物（Rs-F和Rs-R）各240nM、聚合酶0.5U、1×聚合酶缓冲液（Tris-HCl10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用多重PCR技术检测三种马铃薯病原菌的方法，其特征在于，采用多重PCR一次性同时扩增致病疫霉、茄链格孢菌和立枯丝核菌AG3融合群三种病原菌的特异基因，再通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

【技术特征摘要】
1.一种利用多重PCR技术检测三种马铃薯病原菌的方法，其特征在于，采用多重PCR一次性同时扩增致病疫霉、茄链格孢菌和立枯丝核菌AG3融合群三种病原菌的特异基因，再通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。2.根据权利要求1所述的一种利用多重PCR技术检测三种马铃薯病原菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）模板的准备：分别提取致病疫霉、茄链格孢菌和立枯丝核菌AG3融合群三种病原菌的DNA；（2）设计扩增引物：分别设计三对用于扩增三种病原菌特异基因的引物；（3）多重PCR反应：利用步骤（1）的模板和步骤（2）的引物进行多重PCR反应；（4）琼脂糖凝胶电泳检测：对多重PCR反应的产物进行电泳，根据电泳图中目的条带的有无和目的条带的大小来判断样品中是否含有一种或多种病原菌。3.根据权利要求1所述的一种利用多重PCR技术检测三种马铃薯病原菌的方法，其特征在于：所述步骤（2）中三种病原菌特异基因的引物分别为：致病疫霉INF1基因的引物Pi-F和Pi-R，其核苷酸序列为：上游引物Pi-F:5’-TTGTGAAGGCGTCATTCC-3’；下游引物Pi-R:5’-CCGAGAGGATGCTTACGA-3’；茄链格孢菌histoneH3基因的引物As-F和As-R，其核苷酸序列为：上游引物As-F：5’-TCACCTCACT...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹家绥，詹芳芳，王甜，汤一凡，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35