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一种鸭粪便污染检测试剂盒及其制备与应用制造技术

技术编号:21881277 阅读:22 留言:0更新日期:2019-08-17 10:56
本发明专利技术提供了一种鸭粪便污染物特异性检测引物对,所述引物对包含一组正/反向引物对。本发明专利技术还提供了一种基于上述引物对的检测试剂盒及其检测方法与应用,该试剂盒中包含上述特异性鸭粪便污染物检测引物对,还包含一组对照引物对以及适用于PCR扩增的其他反应溶液。本发明专利技术提供的试剂盒能够特异性地检测鸭粪便中Faecalibacterium菌16S rDNA,具有快速、精确的特点,其引物的特异性为100%、阳性率为93.75%,灵敏度为7.95×10

A Kit for Detecting Duck Feces Pollution and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种鸭粪便污染检测试剂盒及其制备与应用
本专利技术属于生物技术检测领域,具体涉及一种鸭粪便污染检测试剂盒及其制备与应用。
技术介绍
随着畜禽食品需求的快速增长,畜禽养殖业也得到了高速发展,然而大规模养殖造成的动物粪便污染问题不容小觑。我国是肉鸭生产和消费大国,养鸭业是我国家禽产业的重要组成部分,有研究报道一个年产10万只肉鸭的养殖场,年产鸭粪量高达546吨,环保压力极大。鸭粪便中存在过量矿物元素,如Cu、Zn、N、P等;抗生素也有可能在粪便中残留;经过发酵分解的粪便会生成有毒有害的物质,如NH4、H2S、吲哚、苯酚等。另外,粪便中还含有大量致病菌,如沙门氏菌、毛首线虫卵、禽流感病毒等,如果排放进江河湖泊中,潜在危害极大。目前,对水体粪便污染的检测主要是通过对水体中粪便指示菌(Fecalindicatorbacteria,FIB)的定量来进行评估,但仅使用FIB只能检测出水体是否受粪便污染及其受污染的程度,无法得知污染的来源、被污染的时间等信息,且检测花费时间较长。现代检测技术中,广泛的将Faecalibacterium菌应用到人类粪便对水体污染的检测中,研究结果显示从60.2%的人类粪便样本和100%的人类粪便污水样本中检测到了此菌。因此,本专利技术提出一种鸭粪便污染检测试剂盒,通过其中包含的特异性引物对可以检测鸭粪便中Faecalibacterium菌16SrDNA,实现快速、精准地检测出水环境中是否含有鸭粪便污染物以及污染程度,具有重要的商业价值。
技术实现思路
有鉴于此,本专利技术的目的之一,在于提供一种检测鸭粪便污染物的引物对,具体方案如下:一种鸭粪便污染物检测引物对,所述引物对包括一组正向引物和反向引物;所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示;所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本研究组前期根据高通量测序结果,对物种间16SrDNA基因序列进行纵向对比分析,首次确定鸭粪便Faecalibacterium菌16SrDNA基因标记物,设计了上述鸭粪便特异性引物对两组。本专利技术的目的之二,在于提供上述鸭粪便污染物检测引物对的应用。上述鸭粪便污染物检测引物对在制备鸭粪便污染物检测试剂或检测试剂盒中的应用。本专利技术的目的之三,在于提供一种检测鸭粪便污染物的试剂盒,具体方案如下:一种鸭粪便污染物检测试剂盒,所述鸭粪便污染物检测试剂盒包含上述鸭粪便污染物检测引物对。进一步,所述鸭粪便污染物检测试剂盒还包含一组对照引物对,所述对照引物对包含正向引物和反向引物;所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示;所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4。本专利技术的试剂盒采用高灵敏性PCR技术来对鸭粪便中的Faecalibacterium菌进行检测,采用所述的鸭粪便污染物检测引物对来进行PCR扩增,以所述对照引物对来进行阳性对照,根据扩增情况可以分析判断鸭粪便中Faecalibacterium菌感染情况。因此,引物对的设计是本专利技术试剂盒的关键。进一步,所述鸭粪便污染物检测试剂盒还包含2×PowerTaqPCRMasterMix。基于本专利技术的试剂盒采用的是PCR技术来进行检测,所以试剂盒中还包含其他一些PCR所需的常规试剂,如:Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或自行配置,因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒,可根据客户实际需要配置,为方便起见,也可全部装配入试剂盒。PCR扩增反应液中,引物、Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs等均为常见组分,其含量亦为常规。如前所述,PCR扩增反应液可以自行配置,也可以直接以市售的不含引物的通用PCR扩增反应液加入特异性引物对获得。例如,本专利技术的试剂盒中还可以含有2×PowerTaqPCRMasterMix,加入本专利技术的鸭粪便污染物检测引物对及对照引物对即可获得PCR扩增反应体系。进一步,所述鸭粪便污染物检测试剂盒还包含阳性对照,所述阳性对照为Faecalibacterium菌保守序列,可以是含有Faecalibacterium菌保守序列的质粒,还可以是灭活的Faecalibacterium菌培养液,还可以采用现有Faecalibacterium菌检测试剂盒中的阳性对照,也可以单独购买或根据现有技术自行构建。进一步,所述鸭粪便污染物检测试剂盒还包含阴性对照,所述阴性对照为不含Faecalibacterium菌的溶液。例如,可以是无菌水(DEPC-H2O)、生理盐水等。本专利技术的目的之四,在于提供一种利用上述试剂盒检测鸭粪便污染物的方法,具体方案如下:一种根据权利上述的鸭粪便污染物检测试剂盒检测鸭粪便污染物的方法,其特征在于,包括以下步骤:1)提取样品DNA;2)加样:将样品DNA与所述鸭粪便污染物检测引物对进行混合,加入其他PCR扩增反应液,并设置空白对照,反应体系为15μL;3)PCR扩增:反应管置于PCR仪上,设置循环参数,进行PCR扩增;4)分析扩增产物。进一步,步骤3)中循环参数为:96℃预变性5min,96℃变性30s,54℃退火30s,72℃延伸30s,72℃总延伸10min,4℃保温10min;一共35个循环。本专利技术的目的之五,在于提供上述检测试剂盒的应用。上述鸭粪便污染物检测试剂盒在制备鸭粪便污染物检测产品中的应用。本专利技术的有益效果在于:本专利技术提供了一种鸭粪便污染检测试剂盒及其检测方法与应用,该试剂盒中包含一组特异性鸭粪便污染物检测引物对,还包含一组对照引物对以及适用于PCR扩增的其他反应溶液。本专利技术提供的试剂盒能够特异性地检测鸭粪便中Faecalibacterium菌16SrDNA,具有快速、精确的特点,其引物的特异性为100%,阳性率为93.75%,灵敏度为7.95×107拷贝/100mL。附图说明图1凝胶电泳图。图2标准曲线图。具体实施方式以下将参照附图,对本专利技术的实施例进行详细描述。所举实施例是为了更好地对本专利技术的内容进行说明,但并不是本专利技术的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述
技术实现思路
对实施方案进行非本质的改进和调整,仍属于本专利技术的保护范围。实施例1引物对合成1)粪便样品采集:本实验采集人、鸭、鸡、猪、狗、牛六个物种粪便样品共246份。所有采集对象必须无肠道相关的疾病且近期未使用过抗生素类药物。2)粪便样品基因组DNA提取:将样品按照PowerDNAIsolationKit的操作说明提取各物种粪便样品的总基因组DNA。3)高通量测序:把所提取的基因组DNA样品按物种(人、鸭、鸡、猪、狗、牛)分类混合成总样品,并做好标记。将标注序号的DNA混合样品进行测序,选择16SrDNA基因的V3-V4区与V5-V6区进行测序。4)引物设计:先将高通量测序序列初步去除低质量序列,再将相似度≥97%的Faecalibacterium菌16SrDNA序列根据物种进行分类,分析比对六个物种Faecalibacterium菌16SrDNA序列,设计多对鸭特异Faecalibacterium菌16SrDNA基因引物,最后经PCR检测筛选出一组特异性最强的基因标记物对;此外还有一组通用引物对。如下表所示:表1SeqIDNO.1FDu-1F本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种鸭粪便污染物检测引物对,其特征在于,所述引物对包括一组正向引物和反向引物;所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种鸭粪便污染物检测引物对,其特征在于,所述引物对包括一组正向引物和反向引物;所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示;所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。2.权利要求1所述的鸭粪便污染物检测引物对在制备鸭粪便污染物检测试剂或检测试剂盒中的应用。3.一种鸭粪便污染物检测试剂盒,其特征在于,所述鸭粪便污染物检测试剂盒包含权利要求1所述的鸭粪便污染物检测引物对。4.根据权利要求3所述的鸭粪便污染物检测试剂盒,其特征在于,所述鸭粪便污染物检测试剂盒还包括对照引物对,所述对照引物对包括一组正向引物和反向引物;所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示;所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4。5.根据权利要求3所述的鸭粪便污染物检测试剂盒,其特征在于,所述鸭粪便污染物检测试剂盒还包含2×PowerTaqPCRMasterMix。6.根据权利要求3所述的鸭粪便污染物检测试剂盒,其特征在于,所述鸭粪便污染物检测试剂盒还包含阳性对照,...

【专利技术属性】
技术研发人员:段传人李丹张娟王顺喜黄直
申请(专利权)人:重庆大学
类型:发明
国别省市:重庆,50

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