本发明专利技术公开了针对超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR试剂盒及检测方法，所述的超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR试剂盒包括两对引物及相应的两种TaqMan探针，它们分别针对blaNDM‑1基因和mcr‑1基因；所述的超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR检测方法是同时检测blaNDM‑1基因和mcr‑1基因的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。本发明专利技术针对blaNDM‑1基因和mcr‑1基因序列设计特异性引物和TaqMan探针，优化扩增反应条件，获得特异性强、敏感性高、重复性好的双重荧光定量PCR检测方法，为blaNDM‑1基因和mcr‑1基因的快速精确检测提供了有效的技术手段。
Double qPCR Kit and Detection of Two Drug Resistance Genes in Super Bacteria
【技术实现步骤摘要】
超级细菌两种耐药基因的双重qPCR试剂盒及检测方法
本专利技术属于基因检测
，具体涉及超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR（qPCR）试剂盒及检测方法。
技术介绍
2009年12月，世界上首次报道在印度发现携带新德里金属β-内酰胺酶1(NewDelhimetallo-β-lactamase-1，简称NDM-1)、具有超强耐药性的肺炎克雷伯氏菌，除对替加环素和多粘菌素敏感外，对β-内酰胺类、碳青霉烯类、大环内酯类、氨基糖苷类及喹诺酮类的多种抗菌药物均具有耐药性。此后，这种耐药的“超级细菌”陆续在巴尔干半岛各国、美国、加拿大、荷兰、中国等国家报道，呈世界性分布。目前，携带blaNDM-1基因的细菌分布广泛，主要发现于肠杆菌科的大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、沙门氏菌以及莫拉菌科的鲍曼不动杆菌等。经研究，发现blaNDM-1基因存在于细菌的质粒上，能够在微生物中发生“水平转移”而广泛传播。理论上，任何细菌只要获得这种质粒，就会产生相应的超级耐药性。2016年，我国科学家在世界上首次报道从来自养殖场的大肠杆菌分离株中发现黏菌素耐药基因mcr-1基因，并证实其编码的MCR-1蛋白具有磷酸乙醇胺转移酶活性，可催化磷酸乙醇胺与脂多糖表面类脂A结合，介导黏菌素耐药。此后，在丹麦、泰国、尼日利亚、法国、英国、加拿大、美国、德国、突尼斯、日本、越南等国家也相继报道。迄今，携带mcr-1基因的细菌主要发现于肠杆菌科的大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、索氏志贺菌等。最近，陆续报道同时携带blaNDM-1基因和mcr-1基因的大肠杆菌、阴沟肠杆菌、无丙二酸枸橼酸杆菌等，加上blaNDM-1基因和mcr-1基因均可通过质粒在相同和不同菌种间水平和垂直传播，使得临床致病菌的耐药性和多重耐药性问题日益严重，给临床医学、兽医学及食品安全等带来严峻挑战，加强对携带blaNDM-1基因和mcr-1基因的细菌的监测和防控尤为重要。当前，国内外许多学者针对blaNDM-1基因和mcr-1基因已研究建立了一些快速检测方法，能够针对blaNDM-1基因或mcr-1基因进行单独检测，这些方法主要包括普通PCR、荧光定量PCR（可简写为qPCR）、环介导等温扩增技术（LAMP）、基因芯片技术等，特别是荧光定量PCR（qPCR），具有操作简单、检测时间短、结果精确等优点，但是迄今未见能同时精确检测blaNDM-1基因和mcr-1基因的快速检测方法。
技术实现思路
针对上述不足，本专利技术的目的在于提供了一种能够同时、快速、精确地检测并区分blaNDM-1基因和mcr-1基因的双重荧光定量PCR（qPCR）试剂盒及检测方法。本专利技术是采用如下技术方案实现的：针对超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR（qPCR）试剂盒，包括两对引物及相应的两种TaqMan探针，它们分别针对blaNDM-1基因和mcr-1基因；所述的两对引物分别为：用于检测blaNDM-1基因的引物：NDM-F：5′-CCTGATCAAGGACAGCAA-3′（序列表的序列1），大小为126bp；NDM-R：5′-TGGCTCATCACGATCATG-3′（序列表的序列2），大小为126bp；用于检测mcr-1基因的引物：mcr-F：5′-CACGGTCTATGATACGAC-3′（序列表的序列3），大小为107bp；mcr-R：5′-CACCCAAACCAATGATAC-3′（序列表的序列4），大小为107bp；所述的两种TaqMan探针分别为：用于检测blaNDM-1基因的TaqMan探针：NDM-P：JOE-CAAGTCGCTCGGCAATCTCG-BHQ1（序列表的序列5），大小为126bp；用于检测mcr-1基因的TaqMan探针：mcr-P：FAM-CTACAGACCGACCAAGCCGA-BHQ1（序列表的序列6），大小为107bp。本专利技术的针对超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR（qPCR）检测方法是同时检测blaNDM-1基因和mcr-1基因的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。针对超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR（qPCR）检测方法，具体包括以下步骤：1）重组质粒标准品构建：根据GenBank上发表的blaNDM-1基因和mcr-1基因的序列，体外合成blaNDM-1基因和mcr-1基因的DNA片段，接着将上述DNA片段分别作为模板进行PCR扩增，然后使用MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0胶回收试剂盒回收、纯化得到PCR产物，连接至pMD18-T载体、转化DH5α感受态细胞，阳性克隆经过增菌培养，然后使用MiniPlasmidKit质粒提取试剂盒提取质粒，进行PCR、酶切及测序鉴定，将经鉴定正确的重组质粒作为阳性标准品，分别命名为p-NDM-1和p-mcr-1；2）待检测样品处理：取待测样品进行总DNA的提取，具体是使用MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0核酸抽提试剂盒提取总DNA，然后将得到的总DNA置于-20℃下保存备用；3）TaqMan荧光定量PCR扩增反应：将步骤1）中得到的阳性标准品和步骤2）中得到的总DNA分别作为检测模板进行TaqMan荧光定量PCR扩增反应，将两种耐药基因的双重荧光定量PCR试剂盒中的引物和TaqMan探针分别用双蒸水稀释成25pmol/μL的溶液，然后与检测模板、PremixExTaqTM试剂、Rox参比染料和双蒸水混合得到扩增反应体系溶液，所述的扩增反应体系溶液具体由以下体积的组分组成：PremixExTaqTM10μL，Rox参比染料0.2μL，NDM-F0.6μL，NDM-R0.6μL，mcr-F0.6μL，mcr-R0.6μL，NDM-P0.4μL，mcr-P0.4μL、检测模板2.0μL、双蒸水4.6μL；接着将所得到的扩增反应体系溶液在荧光定量PCR仪中依次进行如下扩增反应程序：42℃预热5min，95℃预变性30s，95℃变性5s，56℃退火延伸30s，重复循环进行上述的变性和退火延伸程序共40次，同时收集荧光信号；4）结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的Ct值并进行结果判定。进一步，上述双蒸水是经过常规灭菌得到的双蒸水。进一步，步骤4）中所述的结果判定方法是根据扩增曲线和Ct值，当Ct值≤35个循环时可判断结果为阳性，否则即为阴性。进一步，步骤1）中所述的酶切是使用EcoRⅠ内切酶和HindⅢ内切酶。本专利技术方法与现有技术相比较具有以下有益效果：本专利技术为了同时精确检测超级细菌耐药基因blaNDM-1基因和mcr-1基因，分别针对blaNDM-1基因和mcr-1基因的基因序列设计特异性引物和TaqMan探针，并且对双重TaqMan荧光定量PCR检测过程中各种反应条件进行针对性优化改进，建立了同时精确检测blaNDM-1基因和mcr-1基因的双重荧光定量PCR方法。通过试验分析，本专利技术方法可以特异性扩增blaNDM-1基因和mcr-1基因，对超级细菌两种耐药基因的检出下限均为1.63×101copies/μL，比常规的PCR检测方法的敏感性高100倍，组内和组间重复试验的变异本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.针对超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：包括两对引物及相应的两种TaqMan探针，它们分别针对blaNDM‑1基因和mcr‑1基因；所述的两对引物分别为：用于检测blaNDM‑1基因的引物：NDM‑F：5′‑CCTGATCAAGGACAGCAA‑3′，大小为126 bp；NDM‑R：5′‑TGGCTCATCACGATCATG‑3′，大小为126 bp；用于检测mcr‑1基因的引物：mcr‑F：5′‑CACGGTCTATGATACGAC‑3′，大小为107 bp；mcr‑R：5′‑CACCCAAACCAATGATAC‑3′，大小为107 bp；所述的两种TaqMan探针分别为：用于检测blaNDM‑1基因的TaqMan探针：NDM‑P：JOE‑CAAGTCGCTCGGCAATCTCG‑BHQ1，大小为126 bp；用于检测mcr‑1基因的TaqMan探针：mcr‑P：FAM‑CTACAGACCGACCAAGCCGA‑BHQ1，大小为107 bp。
【技术特征摘要】
1.针对超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：包括两对引物及相应的两种TaqMan探针，它们分别针对blaNDM-1基因和mcr-1基因；所述的两对引物分别为：用于检测blaNDM-1基因的引物：NDM-F：5′-CCTGATCAAGGACAGCAA-3′，大小为126bp；NDM-R：5′-TGGCTCATCACGATCATG-3′，大小为126bp；用于检测mcr-1基因的引物：mcr-F：5′-CACGGTCTATGATACGAC-3′，大小为107bp；mcr-R：5′-CACCCAAACCAATGATAC-3′，大小为107bp；所述的两种TaqMan探针分别为：用于检测blaNDM-1基因的TaqMan探针：NDM-P：JOE-CAAGTCGCTCGGCAATCTCG-BHQ1，大小为126bp；用于检测mcr-1基因的TaqMan探针：mcr-P：FAM-CTACAGACCGACCAAGCCGA-BHQ1，大小为107bp。2.针对超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述方法是同时检测blaNDM-1基因和mcr-1基因的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。3.根据权利要求2所述的针对超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：其具体包括以下步骤：重组质粒标准品构建：根据GenBank上发表的blaNDM-1基因和mcr-1基因的序列，体外合成blaNDM-1基因和mcr-1基因的DNA片段，接着将上述DNA片段分别作为模板进行PCR扩增，然后使用MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0胶回收试剂盒回收、纯化得到PCR产物，连接至pMD18-T载体、转化DH5α感受态细胞，阳性克隆经过增菌培养，然后使用MiniPlasmi...
【专利技术属性】
技术研发人员：施开创，屈素洁，尹彦文，粟艳琼，冯淑萍，陆文俊，
申请(专利权)人：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：广西,45
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