一种检测艰难梭菌菌属基因及毒素基因的多重荧光PCR试剂盒和方法技术

本发明专利技术属于细菌检测技术领域，具体公开了一种检测艰难梭菌菌属基因及毒素基因的多重荧光PCR试剂盒和方法，其既能鉴定艰难梭菌菌属又能检测毒素B基因。本发明专利技术的试剂盒主要包括特异性引物组和探针，所述引物组和探针由检测艰难梭菌的引物对和探针、检测毒素B的引物对和探针、内标引物对和探针组成。本发明专利技术通过设计特异性引物组和探针，能从成分复杂的样本中检测出艰难梭菌菌属基因及毒素基因，具有操作简单、报告时间短，特异性强、灵敏度高、准确性好的优点，引入内标准品避免PCR假阴性，降低了由于扩增产物污染而导致的假阳性，适用于临床不明原因腹泻病人的病因筛查。

A multiplex fluorescent PCR kit and method for detection of Clostridium difficile genes and toxin genes

【技术实现步骤摘要】
一种检测艰难梭菌菌属基因及毒素基因的多重荧光PCR试剂盒和方法
本专利技术涉及细菌检测
，具体地，涉及一种检测艰难梭菌菌属基因及毒素基因的多重荧光PCR试剂盒和方法。
技术介绍
艰难梭菌(Clostridiumdifficile，CD)又称难辨梭状芽孢杆菌，由Hall等于1935年首次从健康新生儿粪便中分离，其营养要求较高，常规厌氧培养法不易生长，分离培养较为困难，故因此得名。CD为健康人体中固有菌群的组成部分，约占3％以下，属于条件致病菌，致病与否主要取决于是否为产毒菌株以及细菌数量和产毒量。正常情况下，人体肠道中微生物之间相互依赖、又彼此制约，维持着一定数量和比例的微生态平衡。肠道正常菌群具有一定的抵御病原体的能力，可拮抗和限制CD在肠道内的定殖，并降解其产生的毒素，使得CD不表现致病性。CD对氨节西林、头孢菌素、林可霉素、克林霉素、红霉素、四环素等抗生素耐药，若长期使用这些抗生素(尤其是克林霉素)或出现机体免疫力降低、菌体移位寄生(如胃肠道外科手术或胃管插入)、反复灌肠、使用抗肿瘤化学制剂等情况时均可影响肠道内微生态平衡，引起菌群失调，肠道内的双歧杆菌、乳杆菌等优势菌群对CD的拮抗作用受到限制，耐药的CD大量繁殖而致病，易引起艰难梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection，CDI)，进而引起艰难梭菌相关性腹泻(Clostridiumdifficile-associateddiarrhea，CDAD)和艰难梭菌相关性肠炎(Clostridiumdifficile-associatedcolitis，CDAC)，甚至严重者有致死性假膜性肠炎和中毒性巨结肠，临床多以肠道炎性病变和形成伪膜为主要特点。艰难梭菌分泌的毒素A和B与CDAD发病有关，2个毒素分别由tcdA和tcdB基因编码。此外，负向调节基因tcdC、正向调节基因tcdD以及膜孔蛋白基因tcdE共同构成致病性决定区(PathogenicityLocus，PaLoc)。毒素A对肠道有较强的毒性，有白细胞(WBC)趋化和一定的细胞毒性作用，通过介导黏膜上皮细胞的cAMP系统使水和盐分泌增加，引发分泌性腹泻，甚至黏膜出血；毒素B主要表现为细胞毒性，可刺激单核细胞释放炎性因子，引起炎性反应而引发渗出性腹泻。临床上已发现毒素A阴性而毒素B阳性的CD菌株感染的病例，表明毒素B可单独直接致病。磷酸丙糖异构酶(tpi)是艰难梭菌分泌的一种代谢酶，tpi基因是艰难梭菌的管家基因，具有菌种特异性，可作为一种替代16S核糖体DNA的基因分型标志。CDI实验室诊断主要是分析腹泻患者的粪便标本，检测方法种类多。目前CD实验室检查有细胞培养毒素检测法(CTA)、毒素酶联免疫吸附试验(ELISA)、厌氧培养法、乳酸脱氢酶(GDH)检测、分子生物学检测等。但是，“金标准”CTA法操作难、周期长、成本高，尚未广泛应用于临床微生物实验室；ELISA法因操作简便、快速，而成为目前国内外广泛最应用的检测方法之一，但该方法存在敏感性差、容易漏检的问题；厌氧培养法周期长、成本高，且无法直接检测产毒性艰难梭菌，因此应用较少；GDH法则不能鉴别菌株是否产毒。实时荧光PCR技术以其快速、灵敏、高通量和自动化的特点，逐渐成为艰难梭菌检测的主流检测技术，与其他技术方法相比，其具有线性范围广、闭管污染风险小等优点。但是，现有荧光PCR技术仍然存在假阴性或假阳性，准确性、稳定性和灵敏度低等不足，限制了其在临床上的应用。此外，当待检测样本中含有复杂成分(如全血、易蒙停、泻立停、甲硝唑或万古霉素等)时，现有试剂盒对CD检测的准确性和灵敏度往往不甚理想。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供了一组检测艰难梭菌菌属基因及毒素基因的多重荧光PCR引物组和探针，通过设计特异性引物组和探针，能从成分复杂的样本中检测出艰难梭菌菌属基因及毒素基因，操作简单、报告时间短，特异性强、灵敏度高、准确性好，同时引入内标避免PCR假阴性，降低了由于扩增产物污染而导致的假阳性。本专利技术的另一个目的是提供上述多重荧光PCR引物组和探针在制备检测艰难梭菌菌属基因及毒素基因的多重荧光PCR试剂或试剂盒方面的应用。本专利技术的另一个目的是提供一种检测艰难梭菌菌属基因及毒素基因的多重荧光PCR试剂盒，采用该试剂盒检测的粪便标本无需纯培养，即可在短时间内同时完成艰难梭菌菌属鉴定及菌株毒素携带情况的检测。本专利技术的另一个目的是提供一种检测艰难梭菌菌属基因及毒素基因的多重荧光PCR方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：一组检测艰难梭菌菌属基因及毒素基因的多重荧光PCR引物组和探针，包括tpi扩增引物对tpi-F和tpi-R，tpi荧光探针tpi-P，tcdB扩增引物对tcdB-F和tcdB-R，tcdB荧光探针tcdB-P，内标引物对HP-F和HP-R，内标荧光探针HP-P；核苷酸序列分别依次如SEQIDNO:1～SEQIDNO:9所示。本专利技术采用多重荧光PCR并结合特异性引物和Taqman探针技术，通过设计tpi和tcdB的特异性引物和探针，实现在一个PCR反应中既能鉴定艰难梭菌菌属又能检测毒素B基因的目的。另外，设置了内标准品(简称内标)，内标可对实验过程中可能存在的扩增反应抑制物、仪器、试剂和操作等所导致的假阴性结果进行质量控制。具体方法是：首先在Genebank数据库中通过序列比对，筛选出与艰难梭菌基因组较特异的其他物种来源的靶片段作为备选内标。接着，逐个将备选内标和试剂盒tpi、tcdB靶标进行PCR检测，最后优选HP作为内标。通过对优选出的内标进行引物、探针和模板浓度优化，做到了既保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线，又尽量降低对靶核酸序列检测造成的抑制而导致假阴性。优选地，所述探针的5’末端结合有荧光物质，3’末端结合有淬灭物质；所述荧光物质为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、Cy5中的至少一种；所述淬灭物质为TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3中的至少一种。由于FAM、HEX和Cy5这3种荧光物质的波长距离相对比较大，使它们之间的相互干扰较小，提高了试剂盒的灵敏度。优选地，所述探针的5’末端结合的荧光物质为FAM、HEX、Cy5中的至少一种，3’末端结合的荧光物质为BHQ1。更优选地，所述探针tpi-P、tcdB-P、HP-P的5’末端结合的荧光物质分别为FAM、HEX和Cy5。本专利技术还请求保护上述任一所述多重荧光PCR引物组和探针在制备检测艰难梭菌菌属基因及毒素基因的多重荧光PCR试剂或试剂盒方面的应用。本专利技术还请求保护上述任一所述多重荧光PCR引物组和探针在制备用于检测复杂样本中艰难梭菌菌属基因及毒素基因的试剂或试剂盒方面的应用。所述复杂样本是指待测样品中含有全血、易蒙停、泻立停、甲硝唑或万古霉素中的至少一种杂质。本专利技术还请求保护一种检测艰难梭菌菌属基因及毒素基因的多重荧光PCR试剂盒，包含上述任一所述多重荧光PCR引物组和探针。同样地，该试剂盒可用于检测上述复杂样本中的艰难梭菌菌属基因及毒素基因，因此，所述试剂盒为一种检测复杂样本中艰难梭菌菌属基因及毒素基因的试剂盒。优选地，所述试剂盒的多重荧光PCR反应体系中，tpi-F、tpi-R、tpi-P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一组检测艰难梭菌菌属基因及毒素基因的多重荧光PCR引物组和探针，其特征在于，包括tpi扩增引物对tpi‑F和tpi‑R，tpi荧光探针tpi‑P，tcdB扩增引物对tcdB‑F和tcdB‑R，tcdB荧光探针tcdB‑P，内标引物对HP‑F和HP‑R，内标荧光探针HP‑P；核苷酸序列分别依次如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:9所示。

【技术特征摘要】
1.一组检测艰难梭菌菌属基因及毒素基因的多重荧光PCR引物组和探针，其特征在于，包括tpi扩增引物对tpi-F和tpi-R，tpi荧光探针tpi-P，tcdB扩增引物对tcdB-F和tcdB-R，tcdB荧光探针tcdB-P，内标引物对HP-F和HP-R，内标荧光探针HP-P；核苷酸序列分别依次如SEQIDNO:1～SEQIDNO:9所示。2.根据权利要求1所述多重荧光PCR引物组和探针，其特征在于，所述探针的5’末端结合有荧光物质，3’末端结合有淬灭物质；所述荧光物质为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、Cy5中的至少一种；所述淬灭物质为TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3中的至少一种。3.根据权利要求2所述多重荧光PCR引物组和探针，其特征在于，所述探针的5’末端结合的荧光物质为FAM、HEX、Cy5中的至少一种，3’末端结合的荧光物质为BHQ1。4.权利要求1～3任一所述多重荧光PCR引物组和探针在制备检测艰难梭菌菌属基因及毒素基因的多重荧光PCR试剂或试剂盒方面的应用。5.一种检测艰难梭菌菌属基因及毒素基因的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有对tpi基因、tcdB基因和内标进行检测的试剂。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～3任一所述多重荧光PCR引物组和探针，所述引物组和探针tpi-F、tpi-R、tpi-P、tcdB-F、tcdB-...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗宝花，曾宏彬，陈杰，
申请(专利权)人：广州赛哲生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44