一种胃肠道恶性肿瘤标志物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，特别是指一种胃肠道恶性肿瘤标志物及其应用。所述标志物为WNT4。所述胃肠道恶性肿瘤为人类的胃肠道恶性肿瘤组织，包括胃癌、结直肠癌。所述的标志物作为制备早期诊断胃肠道恶性肿瘤试剂的应用，以WNT4的荧光定量PCR引物对，以待测样本的cDNA为模板进行荧光定量PCR反应，测得WNT4扩增的CT值，并以内参基因β‑actin的CT值进行标准化校正，鉴定待测样本。本发明专利技术通过可靠的荧光定量PCR方法，筛选发现WNT4在胃肠道恶性肿瘤组织中的表达水平明显降低，该方法的灵敏度高，特异性强，可作为胃肠道恶性肿瘤临床早期诊断的标志物。

A Marker of Gastrointestinal Malignant Tumor and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种胃肠道恶性肿瘤标志物及其应用
本专利技术涉及生物医药领域，特别是指一种胃肠道恶性肿瘤标志物及其应用。
技术介绍
随着社会经济发展和饮食结构的改变，胃肠道恶性肿瘤的发病率逐年上升。胃肠道恶性肿瘤包括胃癌和结直肠癌。2018年最新统计数据显示，胃癌和结直肠癌分别位居我国癌症发病率和死亡率的第三位和第四位，严重威胁人民的生命健康。胃肠道作为人体消化和吸收营养最重要的器官，其恶性肿瘤的发生有着相似的病理生理学基础。目前对其发生的机制虽已取得一系列进展，但确切病因尚不能完全明确，目前多认为是环境、遗传、免疫及内分泌等多重因素共同作用的结果。其中胃癌的发生多与幽门螺杆菌的感染相关，临床上约65%的胃癌患者可检测到幽门螺杆菌感染。此外胃癌的发生与地域环境和饮食生活因素有关。在我国北方胃癌发病率高于南方，长期食用富含亚硝酸盐，多环芳烃化合物等致癌物的盐腌、熏烤食品会导致胃癌发病率升高，吸烟者和胃癌患者直系亲属的发病率也较高。结直肠癌的发生与高脂肪低纤维素饮食、肥胖、吸烟、饮酒、2型糖尿病、炎症性肠病、大肠腺瘤、家族性息肉病等多种因素相关。在胃肠道恶性肿瘤发生的早期阶段，通过外科切除术或联合放疗、化疗、靶向治疗、免疫疗法等，早期胃癌和结直肠癌的平均治愈率可分别达到85%和65%以上。但到目前为止，中晚期胃肠道恶性肿瘤患者的临床预后仍然较差。胃镜、肠镜检查，B超及CT等检查手段都能有效发现早期胃肠道恶性肿瘤，因此近几十年来此类疾病的死亡率已呈明显下降趋势。但胃肠道恶性肿瘤起病隐匿，在潜伏期没有明显症状，当出现明显症状时多已进展至中晚期，治疗难度大，这也是导致我国胃癌和结直肠癌患者5年生存率低于全球水平的重要原因之一。因此筛选有效的分子标志物并揭示其在胃肠道恶性肿瘤发生中的作用机制，对于此类疾病的早期诊断和治疗具有重要意义。WNT4属于Wnt家族成员之一，通过激活非经典Wnt信号通路在骨骼、肾脏、女性生殖系统的苗勒管及多种分泌性腺体的发育过程中发挥重要调控作用。目前已明确WNT4基因突变与雄激素增多症、肾脏和尿道先天异常、掌挛缩症等遗传性疾病的发生密切相关。此外，WNT4在调控细胞分化、细胞迁移运动等细胞学行为中也发挥重要作用。WNT4基因表达异常还参与多种恶性肿瘤的发生、侵袭、转移、肿瘤血管生成及淋巴组织侵犯等病理过程。研究表明，WNT4在多种实体瘤中主要发挥抑癌作用。WNT4基因在食管鳞癌组织中的表达水平降低，WNT4/JNK1信号通路的激活水平与食管鳞癌的病理分期、淋巴转移、浸润深度等指标呈负相关。类似地，WNT4在白血病细胞中表达水平也明显降低，过表达WNT4基因会诱导白血病细胞停滞于G1期进而抑制其恶性增殖。促肾上腺皮质激素细胞腺瘤组织中WNT4的表达水平也发生降低，过表达WNT4可以抑制癌细胞的侵袭能力。但也有研究表明，WNT4在某些肿瘤的发生中起着促癌基因的角色。在侵袭性小叶性乳腺癌细胞中过表达WNT4基因会通过激活NF-κB信号通路促进癌细胞的增殖。因此WNT4基因的作用具有一定的组织特异性，需要根据特定的肿瘤类型进行确定。因此本专利技术将检测WNT4基因在胃肠道恶性肿瘤组织中的表达情况，旨在为胃肠道恶性肿瘤检测及风险提示提供新的诊断标志物，并在此基础上研究过表达WNT4基因对胃肠道恶性肿瘤发生的影响，旨在为胃肠道恶性肿瘤的治疗提供新的药物靶向，这对于提高胃肠道恶性肿瘤的早期诊断率及改善胃肠道恶性肿瘤患者的生存状况具有潜在价值。
技术实现思路
本专利技术提出一种胃肠道恶性肿瘤标志物及其应用，促进现胃肠道恶性肿瘤的早期诊断试剂及试剂盒的研究，及制备抑制胃肠道恶性肿瘤基因药物的开发中的问题。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种胃肠道恶性肿瘤标志物，所述胃肠道恶性肿瘤标志物为WNT4。所述胃肠道恶性肿瘤为人类的胃肠道恶性肿瘤组织，包括胃癌、结直肠癌。所述的标志物作为制备早期诊断胃肠道恶性肿瘤试剂的应用，以WNT4的荧光定量PCR引物对，以待测样本的cDNA为模板进行荧光定量PCR反应，测得WNT4扩增的CT值，并以内参基因β-actin的CT值进行标准化校正，鉴定待测样本。所述荧光定量PCR引物对为：正向引物如SEQIDNO：1所示，反向引物如SEQIDNO：2所示。标志物作为制备抑制胃肠道恶性肿瘤药物方法，步骤如下：（1）以WNT4为目标调控基因，构建过表达WNT4基因的载体；（2）利用步骤（1）中的载体，制备用于离体施用或体内施用的药物。所述步骤（1）中过表达WNT4基因包括激活或过表达WNT4编码基因，增加WNT4基因的拷贝数，激活或提高WNT4基因的转录和翻译功能，以及促进WNT4蛋白功能发挥的一种或多种基因。所述步骤（1）中载体为病毒载体或非病毒基因沉默载体；病毒载体为腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体或疱疹病毒载体；非病毒基因过表达载体为CRISPR系统基因激活载体、质粒DNA过表达载体或在此基础上改造的载体。本专利技术的有益效果在于：第一：本专利技术通过可靠的荧光定量PCR方法，筛选发现WNT4在胃肠道恶性肿瘤组织中的表达水平明显降低，该方法的灵敏度高，特异性强，可作为胃肠道恶性肿瘤临床早期诊断的标志物。第二：本专利技术通过大量的实验数据证明，WNT4在胃肠道恶性肿瘤的发生过程中发挥抑癌基因的作用，过表达WNT4基因表达能够显著抑制胃肠道恶性肿瘤细胞的增殖和迁移能力，以及在裸鼠体内的成瘤能力，WNT4可望成为新的防治胃肠道恶性肿瘤的药物。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为荧光定量PCR分析WNT4在不同类型胃肠道恶性肿瘤组织及癌旁正常组织中的mRNA表达情况；（图A）胃腺癌组织及癌旁正常组织（n=15）；（图B）结直肠腺癌组织及癌旁正常组织（n=15）；β-actin作为WNT4的内参对照基因。图2为荧光定量PCR分析，A：在结直肠癌HCT-116细胞中转染WNT4-pEX4过表达质粒后，细胞内WNT4基因mRNA水平的变化；B：在结直肠癌HCT-116细胞中转染WNT4-pEX4质粒后，细胞内WNT4蛋白表达水平的变化。图3为过表达WNT4基因对结直肠癌HCT-116细胞增殖的影响，结直肠癌HCT-116细胞转染WNT4-pEX4的24，48，72小时后，癌细胞的增殖情况。图4为划痕实验分析过表达WNT4基因对结直肠癌HCT-116细胞迁移的影响；A：结直肠癌HCT-116细胞转染WNT4-pEX4的36、72小时后，癌细胞的愈合情况；B：结直肠癌HCT-116细胞转染WNT4-pEX4的36、72小时后，癌细胞的愈合率示意图。图5为裸鼠体内成瘤实验分析过表达WNT4基因对结直肠癌HCT-116细胞体内成瘤能力的影响；A：将稳定过表达WNT4基因的结直肠癌HCT-116细胞或对照细胞接种至裸鼠体内后，移植瘤的实时增殖曲线。每3天测量一次瘤体大小，根据测得瘤体的长度和宽度计算瘤体体积（体积=1/2×长×宽2）。B：不同实验组瘤体的生长情况（代表性图片）及瘤体的重量。*P＜本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胃肠道恶性肿瘤标志物，其特征在于：所述胃肠道恶性肿瘤标志物为WNT4。

【技术特征摘要】
1.一种胃肠道恶性肿瘤标志物，其特征在于：所述胃肠道恶性肿瘤标志物为WNT4。2.根据权利要求1所述的胃肠道恶性肿瘤标志物，其特征在于：所述胃肠道恶性肿瘤为人类的胃肠道恶性肿瘤组织，包括胃癌、结直肠癌。3.权利要求1或2所述的标志物作为制备早期诊断胃肠道恶性肿瘤试剂的应用，其特征在于：以WNT4的荧光定量PCR引物对，以待测样本的cDNA为模板进行荧光定量PCR反应，测得WNT4扩增的CT值，并以内参基因β-actin的CT值进行标准化校正，鉴定待测样本。4.根据权利要求3所述的标志物作为制备早期诊断胃肠道恶性肿瘤试剂的应用，其特征在于：所述荧光定量PCR引物对为：正向引物如SEQIDNO：1所示，反向引物如SEQIDNO：2所示。5.权利要求1所述的标志物作为制备抑制胃肠道恶性肿瘤药...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈卫东，聂小博，王艳东，叶文凌，赵世振，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：河南,41