血液外泌体分子标志物及其在制备肝癌诊断产品中的应用制造技术

血液外泌体分子标志物及其在制备肝癌诊断产品中的应用，本发明专利技术属于生物医学领域，具体涉及与肝癌诊断相关的血液外泌体(miR‑519和/或miR‑521)分子标志物及其在制备肝癌诊断产品中的应用。miR‑519a:CCUCUAGAGGGAAGCGCUUUCU miR‑521:AACGCACUUCCCUUUAGAGUGU。血液Exo‑miR‑519a和/或Exo‑miR‑521是新型生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该生物标志物的开发有助于肝癌的诊断及转移风险预警，并为其他肿瘤类似生物标志物的研制提供借鉴。

Molecular markers of blood exosomes and their application in the preparation of diagnostic products for hepatocellular carcinoma

【技术实现步骤摘要】
血液外泌体分子标志物及其在制备肝癌诊断产品中的应用
本专利技术属于生物医学领域，具体涉及与肝癌诊断相关的血液外泌体(miR-519和/或miR-521)分子标志物及其在制备肝癌诊断产品中的应用。
技术介绍
肝癌是人类常见的恶性肿瘤之一，其死亡率一直高居不下，在所有肿瘤致死原因中位居第三。而主要原因是：第一，基数庞大，全球范围内每年新增50万～100万病例，约有70万人死于肝癌，其5年死亡率更是超过90％。而全球肝癌病例中有半数以上在中国，因此肝癌在我国具有高发性及高危性。肝癌病人治疗后的复发率高，据统计术后5年复发率高达60-70％。而其中侵袭性(浸润-转移)作为恶性肿瘤的主要特点之一，是导致肝癌复发转移甚至患者死亡的重要原因。若能在肿瘤未转移或仅微量转移时就具有有效的临床预警指标，则可为高转移风险患者的早期干预提供依据，进而改善其预后。我们在前期研究中证实PNC(perinucleolarcompartment)作为一种特殊的细胞核结构与肿瘤细胞的转移特性密切相关，因此可作为肿瘤转移预测和预后判断的有效指标。但是PNC作为一个细胞核内结构，其检测需依赖于组织活检。若能以外周血特定指标体现PNC比例，则可为肝癌患者转移风险的预警和预后评估提供有效且便捷的无创诊断标志物。近来，外泌体(exosome)在肿瘤临床诊断中的作用备受关注。Exosome是由多种活细胞分泌的囊泡小体，其中含有蛋白质和RNA等多种组分。这种机体内普遍存在的纳米级被膜结构能够参与细胞间的物质交换和信息交流，在多种生理和病理过程中发挥重要作用。外泌体在外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等体液中具有很高的丰度，因而有望作为循环生物标志物而实现非侵入性的疾病诊断。我们采用肝癌细胞株建立小鼠肝癌转移模型，发现转移灶肝癌细胞的PNC比例远远高于原位灶细胞。分离转移灶和原位灶肝癌组织并行细胞培养，然后对两种细胞培养上清的外泌体miRNA组分进行芯片分析，发现外泌体miR-519(Exo-miR-519)和外泌体miR-521(Exo-miR-521)在高PNC比例(转移灶)的肝癌细胞中显著升高。提示Exo-miR-519和Exo-miR-521有望作为一种PNC相关的新型标志物而用于肝癌转移预警，并用于相关诊断产品的制备。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了可用于肝癌转移预警和预后评估的分子标志物。与肝癌诊断相关的血液外泌体分子标志物：外泌体miR-519a(Exo-miR-519a)和/或外泌体miR-521(Exo-miR-521)，miR-519a:CCUCUAGAGGGAAGCGCUUUCUmiR-521:AACGCACUUCCCUUUAGAGUGU。本专利技术提供了外泌体miR-519a(Exo-miR-519a)和/或外泌体miR-521(Exo-miR-521)标志物用于肝癌诊断相关的应用。本专利技术还提供了用于检测Exo-miR-519a或Exo-miR-521的试剂及其在制备肝癌转移风险预警和预后评估产品中的应用。所述试剂包括任何可用于检测Exo-miR-519a或Exo-miR-521存在与否或表达高低的方法中所使用的试剂。所述检测Exo-miR-519a或Exo-miR-521存在与否或表达高低的方法可采用而不局限于：相对定量RT-PCR、绝对定量PCR、数字PCR。进一步，检测Exo-miR-519a或Exo-miR-521的试剂包括miR-519a或miR-521的逆转录引物或PCR检测引物。miR-519a逆转录引物:CAGCATAGGTCACGCTTATGGAGCCTGGGACGTGACCTATGCTGCAGAAAmiR-519aPCR上游引物：GCCGGGCTCTAGAGGGAAGCGCmiR-519aPCR下游引物：GTCACGCTTATGGAGCCTGGmiR-521逆转录引物:CAGCATAGGTCACGCTTATGGAGCCTGGGACGTGACCTATGCTGACACTCmiR-521PCR上游引物：GCCGGGAACGCACTTCCCTTTAmiR-521PCR下游引物：GTCACGCTTATGGAGCCTGG。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了检测Exo-miR-519a或Exo-miR-521的试剂在制备用于肝癌诊断产品中的应用，尤其是肝癌转移风险预警和预后评估产品中的应用。还提供了一种肝癌转移风险预警和预后评估的诊断产品(试剂盒)。所述诊断产品包括检测Exo-miR-519a或Exo-miR-521的试剂。所述检测Exo-miR-519a或Exo-miR-521存在与否或表达高低的方法可采用而不局限于：相对定量RT-PCR、绝对定量PCR、数字PCR。所述试剂包括miR-519a或miR-521的逆转录引物或PCR检测引物：miR-519a逆转录引物:CAGCATAGGTCACGCTTATGGAGCCTGGGACGTGACCTATGCTGCAGAAAmiR-519aPCR上游引物：GCCGGGCTCTAGAGGGAAGCGCmiR-519aPCR下游引物：GTCACGCTTATGGAGCCTGGmiR-521逆转录引物:CAGCATAGGTCACGCTTATGGAGCCTGGGACGTGACCTATGCTGACACTCmiR-521PCR上游引物：GCCGGGAACGCACTTCCCTTTAmiR-521PCR下游引物：GTCACGCTTATGGAGCCTGG。进一步，所述试剂盒还包括分离外泌体所用的试剂、裂解外泌体所用的试剂。所述分离外泌体所用的试剂包括任何能够分离外泌体的方法中使用的试剂。分离外泌体的方法包括但不局限于超速离心法、沉淀法、分子排阻层析、亲和分离法、免疫磁珠法、超滤法等。本专利技术用于肝癌转移风险预警和预后评估的外泌体来自体液，所述体液包括血液、尿液、唾液、腹水、脑脊液等。优选地，本专利技术的用于肝癌诊断的外泌体来自血液。本专利技术的诊断产品进行肝癌转移风险预警和预后评估的步骤包括：(1)从体液中分离外泌体；(2)检测Exo-miR-519a或Exo-miR-521表达水平；(3)根据Exo-miR-519a或Exo-miR-521表达信息帮助肝癌转移风险预警及预后评估。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了一种肝癌PNC比例分析的无创诊断产品。所述诊断产品包括检测Exo-miR-519a或Exo-miR-521的试剂。所述检测Exo-miR-519a或Exo-miR-521存在与否或表达高低的方法可采用而不局限于：相对定量RT-PCR、绝对定量PCR、数字PCR。所述检测Exo-miR-519a或Exo-miR-521的试剂包括miR-519a和/或miR-521的引物。进一步，所述试剂盒还包括分离外泌体所用的试剂、裂解外泌体所用的试剂。所述分离外泌体所用的试剂包括任何能够分离外泌体的方法中使用的试剂。分离外泌体的方法包括但不局限于超速离心法、沉淀法、分子排阻层析、亲和分离法、免疫磁珠法、超滤法等。本专利技术用于肝癌PNC比例分析的外泌体来自体液，所述体液包括血液、尿液、唾液、腹水、脑脊液等。优选地，本专利技术的用于肝癌诊断的外泌体来自血液。本专利技术的诊断产品进行肝癌PNC比例分析的步骤包括：(1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与肝癌诊断相关的血液外泌体分子标志物，其特征在于：该标志物为外泌体miR‑519a与外泌体miR‑521的一种或两种的组合；miR‑519a:CCUCUAGAGGGAAGCGCUUUCUmiR‑521:AACGCACUUCCCUUUAGAGUGU。

【技术特征摘要】
1.一种与肝癌诊断相关的血液外泌体分子标志物，其特征在于：该标志物为外泌体miR-519a与外泌体miR-521的一种或两种的组合；miR-519a:CCUCUAGAGGGAAGCGCUUUCUmiR-521:AACGCACUUCCCUUUAGAGUGU。2.一种与肝癌诊断相关的试剂，其特征在于：包括用于检测权利要求1所述标志物的试剂。3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：所述试剂包括任何可用于检测Exo-miR-519a或miR-521存在与否或表达高低的方法中所使用的试剂。4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述方法包括：相对定量RT-PCR、绝对定量PCR或数字PCR。5.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：所述试剂包括miR-519a或miR-521的逆转录引物或PCR检测引物：miR-519a逆转录引物:CAGCATAGGTCACGCTTATGGAGCCTGGGACGTGACCTATGCTGCAGAAAmiR-519aPCR上游引物：...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘艳宁，郑敏，楼国华，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33