本发明专利技术公开了一种利用微滴数字化PCR技术用于检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆中游离DNA(cfDNA)的EGFR基因突变的方法及其应用。本发明专利技术提供的Sanomics plasma EGFR检测方法使用非侵入性标本检测EGFR突变，核酸用量较低，最小核酸用量要求仅为10ng，从样本接收到给出结果报告整个检测周转时间仅为2天，具有超高的灵敏度，可检测灵敏度低至0.1％，可同时检测与TKI治疗相关的致敏和抗性突变，如E19缺失、E21 L858R、E20 T790M、E 20 C797S突变，提供突变等位基因频率(MAF)报告。对于NSCLC患者的动态治疗及预后的监测具有重要意义。
Detection and Application of EGFR Based on Micro-droplet Digital Polymerase Chain Reaction
【技术实现步骤摘要】
一种基于微滴数字PCR技术的EGFR检测方法和应用
本专利技术涉及一种利用微滴数字化PCR技术用于检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆中游离DNA(cfDNA)的EGFR基因突变的方法及其应用。
技术介绍
非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的80％，是全球癌症死亡的主要原因。大多数NSCLC患者为晚期疾病，以前的研究表明，靶向表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶的可逆抑制剂可有效延缓部分晚期NSCLC患者的疾病进展并提高生存率。随后发现对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的疾病反应性与EGFR激酶结构域中激活突变相关，EGFR激酶结构域由EGFR基因的外显子18至21编码，在这些突变体中，外显子19的阅读框内缺失和外显子21的L858R占临床上重要的EGFR突变的>85％与TKI的反应性相关，而外显子20的T790M占获得性抗TKI治疗的60％。因此治疗前进行EGFR突变检测，筛选具备EGFR-TKIs治疗指征的患者，治疗中持续监测EGFR突变状态的变化，及时发现耐药突变改变治疗策略，对延长NSCLC患者的生存及预测预后有重要意义。检测EGFR基因突变样本最常用的来源是肿瘤的病理组织或细胞学样本，但是组织取材均为有创操作，难以取得满意的组织或组织量太少不能进行基因突变检测，且随着疾病的进展、EGFR-TKIs耐药的出现，也不易重复实施。有研究报道血浆游离DNA(cfDNA)被认为是一种可能代替肿瘤组织用来检测肿瘤特异性改变的样本，因此本专利技术采用血浆cfDNA样本监测NSCLC患者EGFR基因突变状态，研究EGFR-TKI耐药机制及预测预后的可行性。然而，采用cfDNA检测EGFR基因突变仍有一些技术上的困难需要克服，如大多数人血浆中cfDNA含量较低，cfDNA片段较小，最大约为180bp，肿瘤相关的DNA占比较小，常规的PCR检测技术灵敏度不足等。目前可用于EGFR突变检测的PCR相关技术包括TherascreenEGFRPlasmaRGQPCRKit、EGFRMutationTestv2、IdyllaTMEGFRMutationTest、Sanger测序、下一代测序(NextGenerationSequencing，NGS)、数字PCR(DigitalPCR)等。获得CE-IVD认证的therascreenEGFRPlasmaRGQPCR试剂盒是用于检测EGFR基因中外显子19缺失和外显子20和21取代突变(分别为T790M和L858R)，并提供突变状态的定性评估。当不能获得组织样品时，从血浆样品中提取cfDNA进行检测，检测结果旨在帮助临床医生识别可能受益于IRESSA(吉非替尼)治疗的NSCLC患者。该试剂盒提供了所有必需的试剂，优化用于在野生型cfDNA背景中快速和灵敏地检测相对低百分比的突变体cfDNA。ARMSPCR技术与Scorpions检测技术相结合(蝎形扩增阻滞突变系统)，为突变检测提供了令人满意的灵敏度和特异性。EGFR突变检测v2是CE-IVD认证的等位基因特异性实时荧光PCR检测，其鉴定EGFR基因的外显子18,19,20和21中的42个突变，包括T790M抗性突变。PCR反应在3种反应混合物中多路复用。它被设计用于可以使用单个试剂盒检测组织和血浆样本，并允许在同一个板上同时运行组织和血浆检测。单次PCR，不到4小时获得血浆样本检测结果，不到8小时获得组织样本检测结果。在BiocartisIdyllaTM系统上进行的IdyllaTMEGFR突变检测是用于定性检测EGFR外显子18(G719A/C/S)、外显子21(L858R，L861Q)、外显子20(T790M，S768I)的突变，及外显子19缺失和外显子20插入突变的体外诊断试剂。IdyllaTMEGFR突变检测具有高度的用户友好性，从样品到结果，从福尔马林固定，石蜡包埋(FFPE)NSCLC的人体组织开始，到释放DNA用于后续的real-timePCR扩增和检测，均在单个盒内进行。Sanger测序是一种基于在DNA复制期间通过DNA聚合酶掺入链终止二脱氧核苷酸(ddNTP)的DNA测序技术。与四种不同荧光团连接的四种不同的ddNTP(ddATP，ddTTP，ddCTP和ddGTP)在掺入时终止DNA延伸,随机产生不同长度的DNA片段。当这些片段经受毛细管电泳时，短片段比长片段迁移得更快，并且末端的荧光团发射信号。结果，可以比对DNA片段的序列，从而可以推导出DNA模板的序列。通过使用sanger测序对EGFR基因进行测序，可以分析EGFR的整个序列，从而确定EGFR突变位点。由于突变位点的碱基调用信号与野生型和突变型峰混合，测序检测的灵敏度高度依赖于突变等位基因频率(MAF)。低百分比的突变信号能够被野生型掩盖。通常，Sanger测序的检测下限约为20％MAF。NGS是一种高通量大规模并行测序方法，可以显着缩短测序时间。它可以同时检测多种基因靶标，有几个平台提供含有EGFR基因突变的癌症热点基因组检测。然而，样本的成本在所有技术中最高，并且通常旨在检测由数十个基因组成的基因组，而不是靶向单个基因。数字PCR是基于常规PCR的改进，其可用于直接定量和克隆扩增核酸链。在常规PCR中，在含样本的管内进行单次PCR。然而，对于数字PCR，样品被分离成大量分区，并且在每个分区中单独进行PCR。该方法允许样品中靶核酸的灵敏测量。常规PCR中的PCR资源如引物，核苷酸和酶在核酸之间竞争。如果扩增靶标核酸在总体群体中的数量很少，则它将无法竞争扩增资源，因此在样品中不会被检测到。然而，如果在隔室分区中分离单个靶向核酸模板，则将解决资源竞争的问题，因此靶核酸的信号在大的非靶向核酸群体中是显著的。该方法允许样品中突变体的绝对定量。目前数字PCR主要有三种方法，即基于芯片，基于液滴和基于磁珠。其中，基于芯片数字PCR如ThermoFisherScientific，该技术利用纳米流体芯片，提供方便且直接的机制以并行运行数千个PCR反应，每个孔装载DNA模板，mastermix和AppliedBiosystemsTaqMan测定试剂的混合物，并个体化分析检测终点信号存在(阳性)或不存在(阴性)；微滴数字PCR(DropletDigitalPCR，ddPCR)技术如伯乐公司(Bio-Rad)，提供的油包水乳液微滴系统，微滴在水-油乳液中形成以形成分离模板DNA分子的分区，微滴与进行PCR反应的平板中的个体化检测试管或孔基本上具有相同的功能，但是其小得多的，大规模的样本分区是ddPCR技术的一个关键方面，在传统PCR中，单个样品仅提供单次检测，但在ddPCR中，样品被分成20,000纳升大小的微滴，这种划分使得能够在单个样品内测量数千个独立的扩增事件；基于磁珠的数字PCR技术如OncoBEAMTMEGFR，是基于磁珠的数字PCR方法(也称为BEAMing数字PCR)，允许从单个样品中检测EGFR基因内多达10种不同的突变，涵盖的突变包括6种类型的外显子19缺失、L858R、T790M和C797S，需要2mL血浆样品，单个样品检测时间少于10天，致敏突变的分析灵敏度低至0.03％，抗性突变低至0.04％。表1现有技术的比较和对比由上可见本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于微滴数字PCR的血浆EGFR突变检测方法，包括如下步骤：(1)血浆分离和血浆DNA提取(2)Master mix混合液制备(3)微滴生成(4)封板(5)热循环(6)微滴读取(7)数据分析所述步骤(1)采用Qiagen
【技术特征摘要】
1.一种基于微滴数字PCR的血浆EGFR突变检测方法，包括如下步骤：(1)血浆分离和血浆DNA提取(2)Mastermix混合液制备(3)微滴生成(4)封板(5)热循环(6)微滴读取(7)数据分析所述步骤(1)采用QiagenDSPDNAMini试剂盒，包括利用真空系统提取DNA和Qubit测量DNA浓度的步骤；所述Mastermix含有用于检测EGFR外显子19缺失、外显子21L858R突变、外显子20T790M突变、外显子20C797S突变中一种或多种的引物或探针；所述步骤(3)采用QX200TM微滴生成仪和DG8TM微滴发生卡；所述步骤(4)采用PX1TMPCR封板仪；所述步骤(5)采用C1000TouchTMPCR热循环仪；所述步骤(6)采用QX200微滴分析仪和QuantaSoftTM软件。2.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(1)包括如下步骤：所述血浆分离步骤包括：1)将含有外周血的Streck管以1,600×g，4℃离心10分钟，检查血浆是否清洁且无细胞；2)将约2mL血浆转移到标记管中，将白膜层转移到另一个标记的2mL管中，使白膜层与多余血浆分离；3)以16,000×g，4℃离心2mL血浆10分钟；将至少1700μl离心的血浆转移到三个标记的2mL管中，在分离过程中避免触及细胞团块；将血浆和白膜层层保存在-20℃；所述血浆DNA提取步骤包括通过Qubit测量DNA浓度，血浆DNA的Qubit读数在0.1-3ng/μl之内。3.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(2)中Mastermix混合液由以下成分组成：ddPCRSupermix，10μl；20XPrimerandProbemix，1μl；UNG，0.2μl；水，0.8μl；DNA或水作为NTC阴性对照，8μl；所述PrimerandProbemix为用于检测EGFR外显子19缺失、外显子21L858R突变、外显子20T790M突变、外显子20C797S突变中一种或多种的引...
【专利技术属性】
技术研发人员：施明耀，卢佩莹，辜凯琪，
申请(专利权)人：施明耀，卢佩莹，辜凯琪，
类型：发明
国别省市：中国香港,81
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