DNA甲基化的数字序列分析制造技术

本发明专利技术涉及测定和使用指示腺瘤和癌的特异性甲基化模式的方法和组合物。具体地讲，本发明专利技术涉及对得自癌症和腺瘤样品的DNA中协调甲基化的限定CpG基因座的分析、用于鉴定协调甲基化基因座的方法，以及在腺瘤和癌症的测定法设计中使用对一个或多个标记区域中协调甲基化基因座进行分析的方法。

Digital Sequence Analysis of DNA Methylation

【技术实现步骤摘要】
DNA甲基化的数字序列分析本申请是与母案名称相同的分案申请，母案的中国申请号是201280016745.6，国际申请号是PCT/US2012/023646，申请日是2012年2月2日。相关申请的交叉引用本申请要求于2011年2月2日提交的美国临时专利申请序列第61/438,649号的权益，其以引用方式整体并入本文。
本专利技术涉及测定和使用指示腺瘤和癌的特异性甲基化模式的方法和组合物。具体地讲，本专利技术涉及对得自癌症和腺瘤样品的DNA中协调甲基化的限定CpG基因座的分析，用于鉴定协调甲基化基因座的方法，以及在腺瘤和癌症的测定法设计中使用对一个或多个标记区域中协调甲基化基因座进行分析的方法，所述方法具有改善的灵敏性和特异性。
技术介绍
在高等真核生物中，DNA可在位于CpG二核苷酸中鸟苷5'的胞嘧啶处发生甲基化。这种修饰对于基因表达具有重要的调节作用，特别是在涉及富含CpG的区域时，这种区域称为CpG岛，通常存在于基因的启动子区域。虽然在整个人类基因座中大约75%的CpG位点发生甲基化，但是在CpG岛内的CpG位点通常不发生甲基化，而CpG岛的异常甲基化已与许多疾病相关，包括癌症。例如，CpG岛高甲基化在例如结直肠癌的人类癌症中与限定的肿瘤抑制基因的转录失活相关。因此，检测高甲基化核酸应当能够指示多种形式的癌症的易感性或发生。尽管有迹象表明在CpG岛甲基子表型(CIMP)与癌症之间存在联系（参见例如BaylinSB等，AdvCancerRes1998;72:141–196和JonesPA等，NatRevGenet2002;3:415–428），但是关于单独分析甲基化状态可能是有用的诊断或预后工具的想法仍存在争议。如Issa等在Gastroenterology179(3):2005的一篇社论中所论述，研究人员在确认CI,MP与癌症之间的联系中得到了矛盾复杂的结果。虽然据报道在多种其它恶性肿瘤中已证实了CIMP(Shen,I.等，JNatlCancerInst2002;94:755–761;Garcia-ManeroG等，ClinCancerRes2002;8:2217–2224;ToyotaM等，Blood2001;97:2823–2829;UekiT等，CancerRes2000;60:1835–1839;ToyotaM等，CancerRes1999;59:5438–5442;StrathdeeG等，AmJPathol2001;158:1121–1127;AbeM等，CancerRes2005;65:828–834)并且多个小组已使用相似的标记物和技术证实了原来的发现结果(WhitehallVL等，CancerRes2002;62:6011–6014;vanRijnsoeverM等，Gut2002;51:797–802)，但是其它小组却未能建立此类联系(EadsCA等，CancerRes2001;61:3410–3418;EstellerM等，CancerRes2000;60:129–133)。迟至2003年才有出版物得出结论：在结直肠癌中的所有甲基化事件与老化而非瘤形成相关(YamashitaK等，CancerCell2003;4:121–131)。这些存在矛盾的结果部分地归因于以下事实：已证实在结直肠癌中70%至80%的异常DNA甲基化事件与年龄有关(ToyotaM等，ProcNatlAcadSciUSA1999;96:8681–8686)并且癌症相关的表型只有在过滤掉这些因素后才能清楚。还注意到，过度灵敏的非定量方法会过高估计甲基化并掩盖与癌症相关的和不与癌症相关的甲基化之间的区别。Issa指出“甲基化事件（单独地）无法提供曾被认为是的理想通用癌症标记物，因为CIMP靶基因将不能用于筛选所有结直肠癌（经预测会存在许多假阴性），并且非CIMP靶基因将可能得出高假阳性率，因为它们也在无肿瘤的年长个体表现正常的粘膜中发生甲基化”(Issa等,同上)。一种增加癌症检测中甲基化分析临床特异性的方法是考虑多个标记基因。例如，Zou等调查了癌症样品中BMP3、EYA2、ALX4和波形蛋白的甲基化状态。虽然对于这四个基因的每一个而言甲基化水平在癌症和腺瘤两者中均明显高于正常上皮中的水平，但是通过接受者操作曲线确定的灵敏性未能通过合并任何或所有标记物而与最佳的单个标记物相比得到明显改善。(Zou等，CancerEpidemiolBiomarkersPrev2007;16(12):2686)。Zou还研究了在所述标记基因不止一个中表现出甲基化的新生物并发现共甲基化(co-methylation)频繁发生，其中所测试的72%的癌症和84%的腺瘤表现出在所述基因两个或更多个中的高甲基化。Zou报道了分别在74例癌症的88%、72%、53%和41%以及62例腺瘤的98%、84%、60%和39%中注意到了这四个标记基因中一个或多个（至少一个）、两个或更多个、三个或更多个或四个的甲基化，相比之下在70例正常上皮中为24%、7%、3%和0%，从而表明虽然在将更多的基因包括在共甲基化组中时测定法获得了越来越高的特异性，但是灵敏性急剧下降。
技术实现思路
本专利技术涉及鉴定可用于检测与结直肠癌相关的甲基化的特定基因的区域和基因组核酸的特定区域的方法。方法包括例如以改善的灵敏性和特异性检测例如活检组织、粪便提取物或其它体液中的甲基化序列。在优选实施方案中，本专利技术提供甲基化分析的方法，包括鉴定在将非正常细胞例如癌症或腺瘤细胞中的甲基化与正常细胞中的背景甲基化进行比较时表现出有利甲基化比率的甲基化基因座。在一些实施方案中，本专利技术涉及分析标记序列内一组可能的甲基化位点中多个基因座中每一个处的甲基化的方法，其中在位点的限定组内的所有基因座处存在甲基化的频率在癌症和腺瘤细胞中比在正常细胞中更高，使得在样品中限定的基因座亚组内的所有基因座处发现甲基化则指示腺瘤或癌症。在一些实施方案中，本专利技术提供鉴定标记核酸中甲基化CpG基因座组的方法，其中甲基化指示腺瘤，所述方法包括：a)测定来自多个正常样品的标记核酸的多个独立拷贝的每一个中限定的CpG基因座组的甲基化状态；b)测定来自多个非正常（例如腺瘤或癌症）样品的所述标记核酸的多个独立拷贝的每一个中所述限定的CpG基因座组的甲基化状态以从所述限定组内鉴定限定的CpG基因座亚组，其中在所述限定亚组中的所有所述CpG基因座处发生甲基化的来自所述多个正常样品的所述标记核酸的独立拷贝的百分比小于在所述限定亚组中的所有所述CpG基因座处发生甲基化的来自所述多个非正常样品的所述标记核酸的独立拷贝百分比，并且其中在所述标记核酸中的所述限定亚组内所有所述CpG基因座处的甲基化指示非正常状态，例如腺瘤和/或癌症。在某些实施方案中，在所述多个非正常样品中在所述限定的CpG基因座组内的所有基因座处发生甲基化的标记核酸的独立拷贝的平均百分比大于在多个正常样品中在所述限定的CpG基因座组内的所有基因座处发生甲基化的标记核酸的独立拷贝的平均百分比。在优选实施方案中，在多个非正常样品中在所述限定的CpG基因座组内的所有基因座处发生甲基化的标记核酸的独立拷贝的平均百分比相比在所述多个正常样品中在所述限定的CpG基因座组内的所有基因座处发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定标记核酸中的甲基化CpG基因座组的方法，其中甲基化指示腺瘤，所述方法包括：a)测定来自多个正常样品的标记核酸的多个独立拷贝的每一个中限定的CpG基因座组的甲基化状态；b)测定来自多个腺瘤样品的所述标记核酸的多个独立拷贝的每一个中所述限定的CpG基因座组的甲基化状态以从所述限定组内鉴定限定的CpG基因座亚组，其中在所述限定亚组中的所有所述CpG基因座处发生甲基化的来自所述多个正常样品的所述标记核酸的独立拷贝的百分比小于在所述限定亚组中的所有所述CpG基因座处发生甲基化的来自所述多个腺瘤样品的所述标记核酸的独立拷贝的百分比，并且其中在所述标记核酸中在所述限定亚组内的所有所述CpG基因座处的甲基化指示腺瘤。

【技术特征摘要】
2011.02.02 US 61/4386491.一种鉴定标记核酸中的甲基化CpG基因座组的方法，其中甲基化指示腺瘤，所述方法包括：a)测定来自多个正常样品的标记核酸的多个独立拷贝的每一个中限定的CpG基因座组的甲基化状态；b)测定来自多个腺瘤样品的所述标记核酸的多个独立拷贝的每一个中所述限定的CpG基因座组的甲基化状态以从所述限定组内鉴定限定的CpG基因座亚组，其中在所述限定亚组中的所有所述CpG基因座处发生甲基化的来自所述多个正常样品的所述标记核酸的独立拷贝的百分比小于在所述限定亚组中的所有所述CpG基因座处发生甲基化的来自所述多个腺瘤样品的所述标记核酸的独立拷贝的百分比，并且其中在所述标记核酸中在所述限定亚组内的所有所述CpG基因座处的甲基化指示腺瘤。2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述多个腺瘤样品中在所述限定的CpG基因座组内的所有基因座处发生甲基化的所述标记核酸的独立拷贝的平均百分比大于在所述多个正常样品中在所述限定的CpG基因座组内的所有基因座处发生甲基化的所述标记核酸的独立拷贝的平均百分比。3.根据权利要求2所述的方法，其中在所述多个腺瘤样品中在所述限定的CpG基因座组内的所有基因座处发生甲基化的所述标记核酸的独立拷贝的平均百分比相比在所述多个正常样品中在所述限定的CpG基因座组内的所有基因座处发生甲基化的所述标记核酸的独立拷贝的平均百分比大至少一个标准偏差。4.根据权利要求2所述的方法，其中在所述多个腺瘤样品中在所述限定的CpG基因座组内的所有基因座处发生甲基化的所述标记核酸的独立拷贝的平均百分比相比在所述多个正常样品中在所述限定的CpG基因座组内的所有基因座处发生甲基化的所述标记核酸的独立拷贝的平均百分比大至少两个标准偏差。5.根据权利要求2所述的方法，其中在所述多个腺瘤样品中在所述限定的CpG基因座组内的所有基因座处发生甲基化的所述标记核酸的独立拷贝的平均百分比相比在所述多个正常样品中在所述限定的CpG基因座组内的所有基因座处发生甲基化的所述标记核酸的独...

【专利技术属性】
技术研发人员：DA阿尔奎斯特，WR泰勒，邹鸿志，GP利加德，
申请(专利权)人：精密科学公司，梅奥医学教育和研究基金会工矿企业，
类型：发明
国别省市：美国,US