基于长片段PCR和单分子测序解析多核苷酸重复突变疾病突变结构的方法技术

本发明专利技术提供了基于长片段PCR和单分子测序解析多核苷酸重复突变疾病突变结构的方法。本发明专利技术方法步骤：(a)提供一待测样本，所述待测样本为含基因组DNA的核酸样本；(b)对所述待测样本进行长片段PCR，从而获得第一扩增产物；(c)对所述扩增产物的端部添加条码序列，形成带条码序列的第一扩增产物；(d)对所述的带条码序列的扩增产物进行单分子测序，从而获得对应于所述目标区域的子读序的数据集。基于该数据集，可以准确解析多核苷酸重复突变疾病的突变结构。本发明专利技术具有高效率、高精度和低成本等特点。

Analysis of Mutant Structures of Polynucleotide Repeated Mutation Diseases Based on Long Fragment PCR and Single Molecular Sequencing

【技术实现步骤摘要】
基于长片段PCR和单分子测序解析多核苷酸重复突变疾病突变结构的方法
本专利技术涉及生物
，具体地涉及基于长片段PCR和单分子测序解析多核苷酸重复突变疾病突变结构的方法。
技术介绍
多核苷酸重复突变疾病(repeatexpansiondisease，RED)是一大类因3-12核苷酸重复序列异常扩增致病的遗传性疾病。除比较常见的(CAG)n及(CGG)n等三核苷酸重复扩增突变外，目前有越来越多的多核苷酸重复扩增突变被报道发现。在这类多核苷酸重复突变疾病中，如C9ORF72基因的(GGGGCC)n六核苷酸重复突变、CSTB基因的(CCCCGCCCCGCG)n等其异常重复扩增的序列长度可达几kb甚至几十kb，明确其突变的详细结构，探索不同结构的不同致病机制及与临床表型的关系一直是一大难题。以家族性皮质肌阵挛性震颤癫痫(familialcorticalmyoclonictremorwithepilepsy,FCMTE)为例，该疾病是一组具有明显临床异质性和遗传异质性的常染色体显性遗传性癫痫综合征。FCMTE以成年起病、肢体远端运动性皮质震颤和肌阵挛、伴或不伴癫痫发作为主要临床表现，可合并认知功能损害、痴呆、夜盲、偏头痛、共济失调等症状。电生理学检查可有异常的肌电图、脑电图表现，如皮质来源的巨大体感诱发电位(Giantsomatosensoryevokedpotentials,G-SEP)、长潜伏期皮质反射(Long-latencycorticalreflex,LLCRorC-reflex)。抗癫痫药物治疗有效。FCMTE的临床表型复杂，既往诊断标准中需要结合G-SEP、C-reflex等复杂的电生理检查才可确诊，因此有大量漏诊、误诊案例，导致其无法得到针对性的精准诊治。单分子测序(single-moleculesequencingorlong-readsequencing)技术为这类多核苷酸重复突变提供了新的检测手段，也被其他团队应用于FCMTE的SAMD12基因五核苷酸重复插入突变的研究中，然而也存在种种限制，导致漏检率高，无法提供可靠的序列内容信息，只能属于定性水平的检测，可以见到重复扩增序列的有无，但是无法提供可靠的序列内容信息。此外，全基因组水平的单分子测序，价格非常昂贵，无法在临床检测中进行推广。因此，本领域迫切需要开发新的高效且准确地解析多核苷酸重复突变疾病突变结构的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种新的高效且准确地解析多核苷酸重复突变疾病突变结构的方法。在本专利技术的第一方面，提供了一种对多核苷酸重复突变疾病的突变结构进行解析的方法或一种对多核苷酸重复区域的结构进行解析的方法，所述方法包括步骤：(a)提供一待测样本，所述待测样本为含基因组DNA的核酸样本；(b)对所述待测样本进行长片段PCR，从而获得第一扩增产物；(c)对所述扩增产物的端部添加条码序列，形成带条码序列的第一扩增产物；(d)对所述的带条码序列的扩增产物进行单分子测序，从而获得对应于所述目标区域的子读序(即对应于所述多核苷酸重复区域的子读序)的数据集。在另一优选例中，所述方法还包括：(e)对所述数据集进行分析，从而获得所述目标区域(即多核苷酸重复区域)的突变结构。在另一优选例中，在步骤(c)和(d)之间，还包括：(d0)将所述的带条码序列的第一扩增产物与m-1个带条码序列的扩增产物进行混合，从而获得扩增产物混合文库；其中，所述的m-1个带条码序列的扩增产物是用步骤(a)、(b)和(c)制备的分别带有不同条码序列的第2、第3、…和第m扩增产物，并且所述的扩增产物混合文库含有m种带条码序列的扩增产物；其中，m为≥2的正整数。在另一优选例中，m≥5,较佳地≥10,更佳地≥20,最佳地≥30。在另一优选例中，m为5-5000,较佳地10-2000,更佳地20-500。在另一优选例中，m为5-60,较佳地20-50,更佳地35-45。在另一优选例中，在步骤(d)中，对所述扩增产物混合文库进行单分子测序，从而获得所述的对应于所述目标区域的子读序(即对应于所述多核苷酸重复区域的子读序)的数据集。在另一优选例中，在步骤(e)中，基于不同的条码序列，对所述数据集进行拆分，然后具有相同条码序列的读序进行归类分析，从而分别获得对应于m种待测样本各自的所述目标区域(即多核苷酸重复区域)的突变结构。在另一优选例中，所述的多核苷酸重复区域的长度为200-10000bp，较佳地1500-5000bp。在另一优选例中，所述的多核苷酸重复为3-12nt核苷酸单元的重复。在另一优选例中，所述的多核苷酸重复区域含有一种或多种多核苷酸重复。在另一优选例中，所述的多核苷酸重复突变疾病选自下组：家族性皮质肌阵挛性震颤癫痫(例如1、6、7型家族性皮质肌阵挛性震颤癫痫)；C9ORF72相关的肌萎缩侧索硬化/额颞叶痴呆；脊髓小脑共济失调(例如8、10、31、36、37型脊髓小脑共济失调)；强直性肌营养不良(例如1、2型强直性肌营养不良)。在另一优选例中，在步骤(b)和(c)之间，还包括：(c0)对第一扩增产物进行分离，从而获得经分离纯化的第一扩增产物。在另一优选例中，当所述方法用于m个扩增产物时，对所述m个扩增产物进行分离，从而获得m个经分离的扩增产物。在另一优选例中，用Bluepippin，对扩增产物进行片段分选分离回收。在另一优选例中，所述方法是非诊断和非治疗性的。在本专利技术的第二方面，提供了一种用于诊断家族性皮质肌阵挛性震颤癫痫(FCMTE)的试剂盒，所述的试剂盒含有第一标准品，所述的第一标准品是具有(TTTGA)n1五核苷酸重复插入突变的核酸序列，其中n1为50-800。在另一优选例中，n1为100-500。在另一优选例中，所述的试剂盒还含有第二标准品，所述的第二标准品是具有(TTTCA)n2五核苷酸重复插入突变的核酸序列，其中n2为100-700。在另一优选例中，n2为200-500。在另一优选例中，所述的试剂盒还含有用于长片段PCR的引物对。在另一优选例中，所述的用于长片段PCR的引物对的序列如SEQIDNo:1和2所示。在本专利技术的第三方面，提供了本专利技术第二方面所述的试剂盒的用途，它被用于制备诊断家族性皮质肌阵挛性震颤癫痫(FCMTE)的检测试剂盒。在本专利技术的第四方面，提供了一种检测试剂的用途，所述检测试剂用于检测在SAMD12基因中的(TTTGA)n1五核苷酸重复，其中，所述检测试剂用于制备诊断家族性皮质肌阵挛性震颤癫痫(FCMTE)的检测试剂盒。在本专利技术的第五方面，提供了一种诊断FCMTE的方法，包括步骤：检测所述对象的SAMD12基因中是否存在TTTGA型五核苷酸重复；其中，如果存在TTTGA型五核苷酸重复，则提示该对象患有FCMTE或该对象患有FCMTE的可能性(即易感性)高于正常人群。在本专利技术的第六方面，提供了一种对多核苷酸重复突变疾病的突变结构进行解析的系统(或设备)，所述系统包括：(i)LR-PCR扩增模块，所述LR-PCR扩增模块被配置为：对待测样本进行长片段PCR，从而获得第一扩增产物，其中所述待测样本为含基因组DNA的核酸样本；(ii)扩增产物后处理模块，扩增产物后处理模块被配置为：对所述扩增产物的端部添加条码序列，形成带条码序列的第本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对多核苷酸重复突变疾病的突变结构进行解析的方法，其特征在于，包括步骤：(a)提供一待测样本，所述待测样本为含基因组DNA的核酸样本；(b)对所述待测样本进行长片段PCR，从而获得第一扩增产物；(c)对所述扩增产物的端部添加条码序列，形成带条码序列的第一扩增产物；(d)对所述的带条码序列的扩增产物进行单分子测序，从而获得对应于所述目标区域的子读序的数据集。

【技术特征摘要】
1.一种对多核苷酸重复突变疾病的突变结构进行解析的方法，其特征在于，包括步骤：(a)提供一待测样本，所述待测样本为含基因组DNA的核酸样本；(b)对所述待测样本进行长片段PCR，从而获得第一扩增产物；(c)对所述扩增产物的端部添加条码序列，形成带条码序列的第一扩增产物；(d)对所述的带条码序列的扩增产物进行单分子测序，从而获得对应于所述目标区域的子读序的数据集。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：(e)对所述数据集进行分析，从而获得所述目标区域即多核苷酸重复区域的突变结构。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)和(d)之间，还包括：(d0)将所述的带条码序列的第一扩增产物与m-1个带条码序列的扩增产物进行混合，从而获得扩增产物混合文库；其中，所述的m-1个带条码序列的扩增产物是用步骤(a)、(b)和(c)制备的分别带有不同条码序列的第2、第3、…和第m扩增产物，并且所述的扩增产物混合文库含有m种带条码序列的扩增产物；其中，m为≥2的正整数。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中，对所述扩增产物混合文库进行单分子测序，从而获得所述的对应于所述目标区域的子读序(即对应于所述多核苷酸重复区域的子读序)...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗巍，岑志栋，姜正文，杨德壕，付爱思，胡奔，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33