利用高分辨率熔解曲线法检测瑞格列奈用药相关基因TCF7L2多态性的试剂盒及其方法技术

本发明专利技术公开了一种利用高分辨率熔解曲线法检测瑞格列奈用药相关基因TCF7L2多态性的试剂盒，其特征在于，包括所述TCF7L2基因的多态性位点rs290487的检测引物，所述引物的核苷酸序列如下所示：TCF7L2上游引物：5′‑GCC ATA TTG TTT ACT TTT GGG ATT‑3′；TCF7L2下游引物：5′‑AAC ACC TTT CTC ATT TTC AAT TTT G‑3′；其他部分为HRM分析试剂盒的常规试剂。本发明专利技术还公开了一种利用高分辨率熔解曲线法检测瑞格列奈用药相关基因TCF7L2多态性的试剂盒的检测方法。本发明专利技术的试剂盒适用于对瑞格列奈个体化用药基因进行快速检测，可广泛应用于临床上瑞格列奈个体化用药方案制定的基因检测。

Detection of TCF7L2 Polymorphism in Regglinide Drug-related Gene by High Resolution Melting Curve Method

【技术实现步骤摘要】
利用高分辨率熔解曲线法检测瑞格列奈用药相关基因TCF7L2多态性的试剂盒及其方法
本专利技术属于基因检测领域，具体涉及一种利用高分辨率熔解曲线法检测瑞格列奈用药相关基因TCF7L2多态性的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
瑞格列奈(Repaglinide，商品名：诺和龙)为新型的非磺酰脲类短效口服促胰岛素分泌降糖药。刺激胰腺释放胰岛素使血糖水平快速降低，此作用依赖于胰岛中有功能的β细胞。与其他口服促胰岛素分泌降糖药的不同，在于其通过与不同的受体结合以关闭β细胞膜中APT-依赖性钾通道，使β细胞去极化，打开钙通道，使钙的流入增加，诱导β细胞分泌胰岛素。本品促胰岛素分泌作用较磺酰胺类快。在广泛的临床试验中证明用Repaglinide辅助治疗在控制成人难治性部分高血糖中既有效又被很好地耐受。TCF7L2基因rs290487位点突变导致Repaglinide疗效差异。其中C等位基因携带者控制率显著低于TT型个体，C等位基因为影响疗效的风险因子。由此可见，对TCF7L2基因rs290487位点进行分型检测可预测患者对瑞格列奈的反应性，为临床医生给高血糖患者初次治疗制定药物治疗方案提供依据。因此，TCF7L2基因rs290487位点进行分型检测可预测患者对瑞格列奈的反应性，为临床医生给高血糖患者初次治疗制定药物治疗方案提供依据。开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测TCF7L2基因多态性的试剂盒将为瑞格列奈的临床个体化治疗起到积极的推动作用。高分辨率熔解曲线(high-resolutionmelting，HRM)是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，拥有高敏感性，成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限，闭管操作等特点，符合临床大样本检测要求。
技术实现思路
为了克服现有技术的上述缺陷，本专利技术的目的之一在于提供一种利用高分辨率熔解曲线法检测瑞格列奈用药相关基因TCF7L2多态性的试剂盒，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测瑞格列奈个体化用药相关基因SNP。本专利技术的目的之二在于一种利用高分辨率熔解曲线法检测瑞格列奈用药相关基因TCF7L2多态性的试剂盒的检测方法。为了实现本专利技术的目的之一，所采用的技术方案是：一种利用高分辨率熔解曲线法检测瑞格列奈用药相关基因TCF7L2多态性的试剂盒，包括所述TCF7L2基因的多态性位点rs290487的检测引物，所述引物的核苷酸序列如下所示：TCF7L2上游引物：5′-GCCATATTGTTTACTTTTGGGATT-3′；TCF7L2下游引物：5′-AACACCTTTCTCATTTTCAATTTTG-3′；其他部分为HRM分析试剂盒的常规试剂。为了实现本专利技术的目的之二，所采用的技术方案是：一种利用高分辨率熔解曲线法检测瑞格列奈用药相关基因TCF7L2多态性的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：步骤一，DNA提取步骤：将样本中的DNA提取后保存至冰箱待用；步骤二，高分辨率熔解曲线反应步骤：配制20μlPCR扩增体系，包含：mix10μl，mg2+1.2μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，水7.0μl，模板1.0μl；按照下面的循环参数设置扩增仪：95℃10min4.4℃/s预变性；然后依次在95℃10S4.4℃/s,60℃15S2.2℃/s,72℃20S4.4℃/s,进行40个循环；然后依次在95℃1min4.4℃/s，40℃1min2.2℃/s，65℃1S4.4℃/s，95℃0.02℃/s持续降温采集信号，最终保持在40℃保持30S，得熔解曲线；步骤三，高分辨率熔解曲线结果分析步骤：根据步骤二当中获得的溶解曲线对TCF7L2rs290487位点基因多态性进行检测和判读，判断样本中的基因型属于AA或GG或AG基因型中的任意一种。本专利技术的有益效果在于：本专利技术的试剂盒适用于对瑞格列奈个体化用药基因进行快速准确检测，可广泛应用于临床上瑞格列奈个体化用药方案制定的基因检测。与现有技术相比，本专利技术的引物结合高分辨率熔解曲线技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；HRM反应程序一步完成，不需进行产物纯化测序等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。附图说明图1为本专利技术TCF7L2rs290487位点：野生型、突变型、杂合型高分辨率熔解曲线结果。具体实施方式下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。TCF7L2rs290487位点的核苷酸序列如下：gccatattgtttacttttgggattctgccctttctgtccctcactattttttctatagtaggatatgttgcttgaagaggggtgagtcttccaacccagtacaaatcatggtgacaccacgcaaaattgaaaatgagaaaggtgtt。实施例1：上游引物：5′-GCCATATTGTTTACTTTTGGGATT-3′(SEQIDNO.2)；下游引物：5′-AACACCTTTCTCATTTTCAATTTTG-3′(SEQIDNO.3)；1.DNA提取1.1实验前试剂材料准备与检查工作如下：(1)检查试剂盒保质期以及确保WashBuffer1和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾√；(2)异丙醇(如无，可用无水乙醇替代)和75％乙醇；(3)高压灭菌有效期内的1.5mLEppendorf管和各类移液枪头。1.2从4℃冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；1.3在1.5mLEppendorf管对应标本唯一性标识做好标记；1.4分别移取900μlCellLysisSolution加至灭菌的1.5mLEppendorf管；1.5小心移取300μl全血转移至上述加有CellLysisSolution的1.5mLEP管；1.6盖上Eppendorf管盖，室温孵育10min；1.713,000rpm室温离心20秒；1.8取出Eppendorf管，观察白色沉淀；1.9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；1.10盖上Eppendorf管，用手指弹击Eppendorf管底部，使白色沉淀重悬；1.11移取300μlNucleiLysisSolution入上述Eppendorf管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；1.12打开Eppendorf管，移取100μlProteinPrecipitationSolution入上述Eppendorf管中，盖上管管，振荡器上剧烈振荡20秒；13,000rpm室温离心3min；1.13移取上清转移到新的已灭菌1.5mLEppendorf管；1.14移取300μl异丙醇入Eppendorf管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析出；1.1513,000rpm室温离心1min；1.16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清；1.17移取300μl75％乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；1.1813,000rpm室温离心1min；1.19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清；1.20在实验台上放置新滤纸，倒扣Eppendorf管，吸干本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用高分辨率熔解曲线法检测瑞格列奈用药相关基因TCF7L2多态性的试剂盒，其特征在于，包括所述TCF7L2基因的多态性位点rs290487的检测引物，所述引物的核苷酸序列如下所示：TCF7L2上游引物：5′‑GCC ATA TTG TTT ACT TTT GGG ATT‑3′；TCF7L2下游引物：5′‑AAC ACC TTT CTC ATT TTC AAT TTT G‑3′；其他部分为HRM分析试剂盒的常规试剂。

【技术特征摘要】
1.一种利用高分辨率熔解曲线法检测瑞格列奈用药相关基因TCF7L2多态性的试剂盒，其特征在于，包括所述TCF7L2基因的多态性位点rs290487的检测引物，所述引物的核苷酸序列如下所示：TCF7L2上游引物：5′-GCCATATTGTTTACTTTTGGGATT-3′；TCF7L2下游引物：5′-AACACCTTTCTCATTTTCAATTTTG-3′；其他部分为HRM分析试剂盒的常规试剂。2.如权利要求1所述的一种利用高分辨率熔解曲线法检测瑞格列奈用药相关基因TCF7L2多态性的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，DNA提取步骤：将样本中的DNA提取后保存至冰箱待用；步骤二，高分辨率熔解曲线反应步骤：配制20μlPC...

【专利技术属性】
技术研发人员：何小明，钱怡，孙子奎，
申请(专利权)人：上海派森诺生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31