定量检测核酸的方法及表面等离子共振生物传感器技术

本公开涉及一种定量检测核酸的方法及表面等离子共振生物传感器。本公开的无标样定量检测核酸的方法基于表面等离子共振原理和分析物的扩散性与分析物绝对浓度之间的关系，实现了特异性定量检测核酸，克服了传统实时荧光定量PCR方法的耗时长、费用高、不能绝对定量且不可再生、不能实时监控的缺点，具有灵敏度高、特异性强、无需标记及可绝对定量等优点。整个样品分析过程包括结合、平衡/解离、再生三个过程，其中芯片的再生即分析物离开芯片表面探针的过程，该过程中芯片表面探针活性和结构不受影响，因此可实现传感器的重复利用。

Quantitative Detection of Nucleic Acids and Surface Plasmon Resonance Biosensor

【技术实现步骤摘要】
定量检测核酸的方法及表面等离子共振生物传感器
本专利技术属于生物技术产品分析测试领域，具体涉及一种定量检测核酸的方法及表面等离子共振生物传感器。
技术介绍
核酸测量方法的准确度(包括正确度和精密度)是现代分析化学和分子生物学研究面临的重要挑战之一。建立核酸含量的准确测量方法，实现核酸定量结果的准确和溯源是生物分析研究的重点之一。目前，核酸定量检测主要包括两种方法：一种是实时荧光定量PCR(Real-timePCR)方法，该方法反应时间较长、实验程序复杂、且需要利用标准品制作实验用标准曲线；另一种则是数字PCR(ddPCR)方法，该方法虽为无需制作标准曲线的绝对定量方法，但实验成本较高，而且反应中所需的试剂、耗材均为一次性使用，不可再生。
技术实现思路
本公开的目的是提供一种既能实现无需标准曲线的绝对定量，又可再生的生物传感器及定量检测核酸的方法。为了实现上述目的，本公开第一方面提供一种定量检测核酸的方法，该方法包括如下步骤：S1，根据目标核酸的基因序列选取与所述目标核酸互补的单链DNA备选探针；S2，将所述备选探针以第一偶联量偶联于表面等离子共振生物传感器的传感芯片表面；S3，将含有已知浓度的所述目标核酸的溶液流经所述传感芯片并检测RU值响应信号，根据所述RU值响应信号计算得到质量控制参数QCratio；S4，当QCratio不满足可靠性条件时，改变所述备选探针的第一偶联量后再次进行步骤S3，并再次验证得到的QCratio是否满足所述可靠性条件；和/或重新选取与所述目标核酸互补的单链DNA备选探针后再次进行步骤S2和S3，并再次验证得到的QCratio是否满足所述可靠性条件；其中，所述第一偶联量为800～1200RU；所述可靠性条件包括：QCratio≥0.2；S5，重复步骤S4直至QCratio满足所述可靠性条件；S6，当QCratio满足所述可靠性条件时，所述备选探针作为检测探针以第二偶联量偶联于所述传感芯片表面；将含有待测物的待测液流经所述传感芯片并检测待测液的RU值响应信号；若未产生RU值响应信号，则所述待测物中不含有所述目标核酸；若产生RU值响应信号，则所述待测物中含有所述目标核酸，根据所述待测液的RU值响应信号计算得到所述待测液中的所述目标核酸的浓度，其中，所述第二偶联量为1400～2000RU。可选地，所述传感芯片表面结合有链霉亲和素；所述备选探针的5’端标记有生物素，所述备选探针的长度为23～30bp。可选地，所述偶联包括如下步骤：将含有所述备选探针的偶联溶液流经所述芯片，使所述备选探针与所述芯片表面结合，得到所述表面等离子共振生物传感器。可选地，所述偶联溶液还含有HEPES、NaCl、EDTA和SurfactantP20；所述备选探针在所述偶联溶液中的浓度为20～100nM，所述偶联溶液流经所述传感芯片的流速为5～10uL/min。可选地，该方法包括：步骤S4中，首先改变所述备选探针的所述第一偶联量后再次进行步骤S3，并再次验证得到的QCratio是否满足所述可靠性条件，其中所述第一偶联量在800～1200RU的范围内改变；当在800～1200RU内的偶联量无法使QCratio满足所述可靠性条件时，重新选取与所述目标核酸互补的单链DNA备选探针后再次进行步骤S2和S3，并再次验证得到的QCratio是否满足所述可靠性条件。可选地，步骤S6中，所述待测液流经所述传感芯片的流速为2～100μL/min，时间为120～180s；所述待测液还含有浓度为10～13mM的HEPES、浓度为130～150mM的NaCl、浓度为3～5mM的EDTA和浓度为0.05～0.1体积％的SurfactantP20，所述待测液的pH为7.4～8.0。可选地，该方法还包括：在步骤S6之后，将所述传感芯片再生。可选地，所述再生的方法包括：使再生试剂与所述传感芯片接触30s～60s进行再生处理；所述再生试剂为质量浓度为0.05％SDS溶液和/或浓度为30～40mM的NaOH溶液。可选地，所述目标核酸为农癌杆菌终止子基因；所述探针的核苷酸序列为SEQIDNO：1所示的序列。本公开第二方面提供一种用于定量检测核酸的表面等离子共振生物传感器，所述传感器为本公开第一方面所述的表面等离子共振生物传感器。通过上述技术方案，本公开建立了一种定量检测核酸的方法，一方面，该方法基于表面等离子体共振原理，通过在表面等离子体共振(SPR)传感芯片上偶联与转基因目标分析物互补的单链DNA探针，利用SPR光学传感的原理，获得探针捕获分析物的信号，以实现对目标核酸的分析，在适宜条件下，分析物中存在的目标DNA与芯片表面的互补DNA探针结合，该传感器通过芯片表面重量改变所引起的光学角度的改变而产生信号响应；当改变条件以破坏两者之间的结合时，目标DNA便会从形成的双链DNA复合物中解离下来，而芯片表面的单链DNA探针并不会受到影响，因此便实现了传感器的再生。另一方面，该方法借助分析物的扩散性与分析物绝对浓度之间的关系，利用已知的分析物的扩散系数，通过在扩散速率部分限制条件下的结合速率能够计算分析物的浓度，从而无需借助标样，可直接得到分析物浓度数据。本公开的无标样定量分析方法克服了传统实时荧光定量PCR方法的耗时长、费用高、不能绝对定量且不可再生、不能实时监控的缺点，具有灵敏度高、特异性强、无需标记及可绝对定量等优点。整个样品分析过程包括结合、平衡/解离、再生三个过程，其中芯片的再生即分析物离开芯片表面偶联的探针的过程，该过程中芯片表面探针活性和结构不受影响，因此可实现传感器的重复利用。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：图1是本公开的检测转基因植物的方法的一种实施方式的芯片表面物质迁移过程示意图；图2是本公开实施例1的再生条件筛选结果图；图3是本公开的t-nostarget1QCratio值与偶联量关系；图4是本公开的t-nostarget2QCratio值与偶联量关系；图5是本公开的t-nostarget3QCratio值与偶联量关系。具体实施方式以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。本公开第一方面提供一种定量检测核酸的方法，该方法包括如下步骤：S1，根据目标核酸的基因序列选取与目标核酸互补的单链DNA备选探针；S2，将备选探针以第一偶联量偶联于表面等离子共振生物传感器的传感芯片表面；S3，将含有已知浓度的目标核酸的溶液流经传感芯片并检测RU值响应信号，根据RU值响应信号计算得到质量控制参数QCratio；S4，当QCratio不满足可靠性条件时，改变探针的第一偶联量后再次进行步骤S3，并再次验证得到的QCratio是否满足可靠性条件；和/或重新选取与目标核酸互补的单链DNA备选探针后再次进行步骤S2和S3，并再次验证得到的QCratio是否满足可靠性条件；其中，第一偶联量为800～1200RU；可靠性条件包括：QCratio≥0.2；S5，重复步骤S4直至QCratio满足可靠性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定量检测核酸的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：S1，根据目标核酸的基因序列选取与所述目标核酸互补的单链DNA备选探针；S2，将所述备选探针以第一偶联量偶联于表面等离子共振生物传感器的传感芯片表面；S3，将含有已知浓度的所述目标核酸的溶液流经所述传感芯片并检测RU值响应信号，根据所述RU值响应信号计算得到质量控制参数QCratio；S4，当QCratio不满足可靠性条件时，改变所述备选探针的第一偶联量后再次进行步骤S3，并再次验证得到的QCratio是否满足所述可靠性条件；和/或重新选取与所述目标核酸互补的单链DNA备选探针后再次进行步骤S2和S3，并再次验证得到的QCratio是否满足所述可靠性条件；其中，所述第一偶联量为800～1200RU；所述可靠性条件包括：QCratio≥0.2；S5，重复步骤S4直至QCratio满足所述可靠性条件；S6，当QCratio满足所述可靠性条件时，所述备选探针作为检测探针以第二偶联量偶联于所述传感芯片表面；将含有待测物的待测液流经所述传感芯片并检测待测液的RU值响应信号；若未产生RU值响应信号，则所述待测物中不含有所述目标核酸；若产生RU值响应信号，则所述待测物中含有所述目标核酸，根据所述待测液的RU值响应信号计算得到所述待测液中的所述目标核酸的浓度，其中，所述第二偶联量为1400～2000RU。...

【技术特征摘要】
1.一种定量检测核酸的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：S1，根据目标核酸的基因序列选取与所述目标核酸互补的单链DNA备选探针；S2，将所述备选探针以第一偶联量偶联于表面等离子共振生物传感器的传感芯片表面；S3，将含有已知浓度的所述目标核酸的溶液流经所述传感芯片并检测RU值响应信号，根据所述RU值响应信号计算得到质量控制参数QCratio；S4，当QCratio不满足可靠性条件时，改变所述备选探针的第一偶联量后再次进行步骤S3，并再次验证得到的QCratio是否满足所述可靠性条件；和/或重新选取与所述目标核酸互补的单链DNA备选探针后再次进行步骤S2和S3，并再次验证得到的QCratio是否满足所述可靠性条件；其中，所述第一偶联量为800～1200RU；所述可靠性条件包括：QCratio≥0.2；S5，重复步骤S4直至QCratio满足所述可靠性条件；S6，当QCratio满足所述可靠性条件时，所述备选探针作为检测探针以第二偶联量偶联于所述传感芯片表面；将含有待测物的待测液流经所述传感芯片并检测待测液的RU值响应信号；若未产生RU值响应信号，则所述待测物中不含有所述目标核酸；若产生RU值响应信号，则所述待测物中含有所述目标核酸，根据所述待测液的RU值响应信号计算得到所述待测液中的所述目标核酸的浓度，其中，所述第二偶联量为1400～2000RU。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述传感芯片表面结合有链霉亲和素；所述备选探针的5’端标记有生物素，所述备选探针的长度为23～30bp。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述偶联包括如下步骤：将含有所述备选探针的偶联溶液流经所述芯片，使所述备选探针与所述芯片表面结合，得到所述表面等离子共振生物传感器。4.根据权利要求3所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：李亮，金芜军，安娜，宛煜嵩，刘卫晓，郑子繁，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11