基于变色银纳米簇和杂交链式反应的miRNA检测方法技术

本案涉及一种基于变色银纳米簇和杂交链式反应的miRNA检测方法，包括：将捕获探针、结合有信号探针的银纳米簇及辅助探针加入到待测液中反应后，通过比较结合有信号探针的银纳米簇在反应前后的荧光强度，实现对目标miRNA的定量检测；其中，捕获探针被设置为能够特异性捕获目标miRNA；信号探针被设置为当捕获探针特异性捕获目标miRNA后，其DNA结构在辅助探针存在条件下被改变，从而使得结合有信号探针的银纳米簇的荧光发生变色。本案通过结合变色银纳米簇的识别/信号输出及杂交链式反应的信号放大性能，实现了miRNA的高灵敏度、高特异性的荧光检测。

Detection of MicroRNAs Based on Coloured Silver Nanoclusters and Hybrid Chain Reaction

【技术实现步骤摘要】
基于变色银纳米簇和杂交链式反应的miRNA检测方法
本专利技术涉及miRNA检测
，特别涉及一种基于变色银纳米簇和杂交链式反应的miRNA检测方法。
技术介绍
MicroRNA(miRNA)是一类长度为18-25个核苷酸的内源性非编码小分子单链RNA，miRNA普遍存在于真核细胞中。传统的检测方法包括Northern印迹杂交法，微阵列分析法和实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)等。尽管这些方法的准确性好，但在实际应用中仍存在一些不足。例如Northern印迹杂交法耗时费力，对待测样品都需求量大，不能用于低丰度miRNA的检测；微阵列分析法可以实现miRNA的多重检测，但是其灵敏度不足，特异性差，动态范围窄，此外芯片的制作和检测费用高；qRT-PCR的灵敏度高，但是miRNA序列短，限制了其逆转录步骤，此外，qRT-PCR通常需要复杂的引物设计和精确控温。
技术实现思路
针对现有技术中的不足之处，本专利技术提供了一种基于变色银纳米簇和杂交链式反应的miRNA检测方法，以期通过对现有miRNA检测手段的改进，实现对miRNA的高灵敏度、高特异性荧光检测。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种基于变色银纳米簇和杂交链式反应的miRNA检测方法，其包括：将捕获探针、结合有信号探针的银纳米簇及辅助探针加入到待测液中反应后，通过比较结合有信号探针的银纳米簇在反应前后的荧光强度，实现对目标miRNA的定量检测；其中，捕获探针被设置为能够特异性捕获目标miRNA；信号探针被设置为当捕获探针特异性捕获目标miRNA后，其DNA结构在辅助探针存在条件下被改变，从而使得结合有信号探针的银纳米簇的荧光发生变色。优选的是，所述的miRNA检测方法，其中，所述捕获探针具有第一特定结构。优选的是，所述的miRNA检测方法，其中，所述信号探针具有第二特定结构。优选的是，所述的miRNA检测方法，其中，所述捕获探针被设置为当其捕获目标miRNA后，所述第一特定结构被改变，并游离出特定单链。优选的是，所述的miRNA检测方法，其中，所述信号探针被设置为所述第二特定结构能够与游离出的特定单链反应，并在辅助探针的存在下，触发杂交链式反应，导致信号探针的DNA结构被改变，使结合有信号探针的银纳米簇的荧光发生变色。优选的是，所述的miRNA检测方法，其中，所述第一特定结构为颈环结构。优选的是，所述的miRNA检测方法，其中，所述第二特定结构为颈环结构。优选的是，所述的miRNA检测方法，其中，当目标miRNA为miR-17-5p时，捕获探针的序列为：AATCCCAATCCCAATCCCCTACCTGCACTGTAAGCACTTTGGGGATTGGGATT；辅助探针的序列为：GGGATTGGGATTGGGATTGTGATGAATCCCAATCCC。优选的是，所述的miRNA检测方法，其中，当目标miRNA为miR-17-5p时，信号探针的序列为：CCCCCTTAATCCCCCTTTTTTTAATCCCAATCCCAATCCCGGGATTGGGATTCATCACAAAAAAACCCCCTAATTCCCCC。本专利技术的有益效果是：本案通过结合变色银纳米簇的识别/信号输出及杂交链式反应的信号放大性能，实现了miRNA的高灵敏度、高特异性的荧光检测。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为基于变色银纳米簇和杂交链式反应的miRNA检测方法的原理示意图。图2为模板化银纳米簇的光谱图；其中，图2(A)为A20NC模板化银纳米簇及T20NC模板化银纳米簇的紫外可见吸收光谱图；图2(B)为A20NC、T20NC、A20NC/T20NC模板化银纳米簇的荧光光谱图。图3为信号探针模板化银纳米簇与miRNA反应杂交后的测试分析图；其中，图3(A)为信号探针模板化银纳米簇与不同浓度miRNA反应杂交后的荧光发射光谱图；图3(B)为荧光强度与miRNA对数浓度的关系曲线图；图3(C)为红色荧光/黄色荧光强度比值与miRNA对数浓度的关系图。图4为错配miRNA分子与血清中加入目标miRNA分子后的荧光比值柱状图。图5为HeLa细胞共聚焦成像图：(A)为只加入信号探针后；(B)为加入信号探针、捕获探针及辅助探针后。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。此外，下面所描述的本专利技术不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。本案的检测原理如图1所示，设计具有特定结构(例如可以是颈环结构)的信号探针(signalprobe)，以其部分区域为模板，通过硼氢化钠还原硝酸银，首先合成出能够发射某一颜色荧光(例如是红光)的银纳米簇；设计具有特定结构(例如可以是颈环结构)的捕获探针(captureprobe)，具有特定结构(例如是颈环结构)的捕获探针可以与目标miRNA结合，从而改变特定结构(例如打开颈环结构)，游离出的单链DNA可以改变信号探针的特定结构(例如打开颈环结构)，在辅助探针(auxiliaryprobe)的存在下，触发杂交链式反应，信号探针上的DNA结构进而发生改变，导致红色荧光银纳米簇变色为另一种颜色荧光(例如是黄色)银纳米簇。通过监测两种荧光的发射强度，可实现对目标miRNA的定量分析，也可以为细胞内荧光成像提供基础和材料。实施例以miR-17-5p作为目标miRNA为例，本实施例涉及的DNA与RNA序列如表1：表1DNA与RNA序列操作具体为：(1)DNA模板化银纳米簇的合成：将DNA序列(包括信号探针，以及用作对比的序列A20NC或T20NC或A20NC/T20NC)加热到95℃，保持5分钟，然后缓慢冷却到室温。将DNA与硝酸银在PBS(pH7.4)中进行混合，搅拌30秒，反应1小时后，加入硼氢化钠，剧烈搅拌1分钟。DNA、硝酸银与硼氢化钠的比例保持为1：10：10。随后，将反应后的产物置于黑暗中，然后保存待用。(2)miRNA定量分析：将标准品的目标miRNA(miR-17-5p)溶于纯净水中，配置不同浓度的miR-17-5p。然后将其与15μM捕获探针、信号探针及辅助探针混合，放置于室温下反应4小时；接着进行荧光检测。作为对比试验，将上述操作中的信号探针分别替换为A20NC或T20NC或A20NC/T20NC。试验结果参见图2和图3。作为对比例，A20NC和T20NC也具有颈环结构。(3)选择性研究：合成4段单碱基与双碱基错配的miRNA(mismatch1、mismatch2、mismatch3和mismatch4)，将它们配制为10nM浓度的溶液，并与捕获探针，信号探针及辅助探针混合，反应4小时后，记录荧光光谱，并与目标miRNA反应后体系的荧光进行比较。试验结果参见图4。(4)细胞原位成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于变色银纳米簇和杂交链式反应的miRNA检测方法，其特征在于，包括：将捕获探针、结合有信号探针的银纳米簇及辅助探针加入到待测液中反应后，通过比较结合有信号探针的银纳米簇在反应前后的荧光强度，实现对目标miRNA的定量检测；其中，捕获探针被设置为能够特异性捕获目标miRNA；信号探针被设置为当捕获探针特异性捕获目标miRNA后，其DNA结构在辅助探针存在条件下被改变，从而使得结合有信号探针的银纳米簇的荧光发生变色。

【技术特征摘要】
1.一种基于变色银纳米簇和杂交链式反应的miRNA检测方法，其特征在于，包括：将捕获探针、结合有信号探针的银纳米簇及辅助探针加入到待测液中反应后，通过比较结合有信号探针的银纳米簇在反应前后的荧光强度，实现对目标miRNA的定量检测；其中，捕获探针被设置为能够特异性捕获目标miRNA；信号探针被设置为当捕获探针特异性捕获目标miRNA后，其DNA结构在辅助探针存在条件下被改变，从而使得结合有信号探针的银纳米簇的荧光发生变色。2.根据权利要求1所述的miRNA检测方法，其特征在于，所述捕获探针具有第一特定结构。3.根据权利要求2所述的miRNA检测方法，其特征在于，所述信号探针具有第二特定结构。4.根据权利要求3所述的miRNA检测方法，其特征在于，所述捕获探针被设置为当其捕获目标miRNA后，所述第一特定结构被改变，并游离出特定单链。5.根据权利要求4所述的miRNA检测方法，其特征在于，所述信号探针被设置为所述第二特定结构能够与游离出的特定单链反应，并在...

【专利技术属性】
技术研发人员：缪鹏，蒋依婷，梅茜，徐军，王明元，陈炜，汤龙海，
申请(专利权)人：济南国科医工科技发展有限公司，苏州市中心血站，
类型：发明
国别省市：山东,37