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一种检测致病疫霉抗药性的方法技术

技术编号:21881157 阅读:45 留言:0更新日期:2019-08-17 10:54
本发明专利技术公开了一种检测致病疫霉抗药性的方法,选择实验用马铃薯块茎组织规格;配制不同浓度的甲霜灵试剂;以上表面滴药法向马铃薯块茎组织上进行甲霜灵试剂的滴加;在马铃薯块茎组织上放置活化好的敏感、中抗和高抗的致病疫霉菌饼,20℃黑暗处理5天;根据菌丝体在马铃薯块茎组织表面占有的面积以及腐烂程度,确定致病疫霉的抗药性。本发明专利技术用于对马铃薯块茎组织进行致病疫霉抗药性检测,与传统方法相比较,准确性为99%以上,检测成本可降低85%,大大提高了检测效率。

A Method for Detecting Resistance of Phytophthora infestans

【技术实现步骤摘要】
一种检测致病疫霉抗药性的方法
本专利技术涉及病原菌检测
,特别是一种检测致病疫霉抗药性的方法。
技术介绍
植物病原菌抗药性是指病原菌长期在单一药剂或同类药剂选择作用压力下,通过遗传、变异而对此药剂获得的适应性。随着2015年我国开始实施马铃薯主粮化战略,50%以上的马铃薯作为主食来利用,全国范围开始扩大了马铃薯的种植面积。但是,由于近几年夏季雨水较多,马铃薯发生严重的病害,使得马铃薯大面积减产,给经济带来了重创。马铃薯晚疫病(PotatoLateBlight)是由致病疫霉所引起的马铃薯生产中最具毁灭性的病害],每年造成的损失全球达到35亿美元,全国达到10亿美元,且危害性与防治难度逐年加大。目前各国防治马铃薯晚疫病的方法主要为化学药剂防治。甲霜灵是晚疫病防治过程中常用的化学药剂之一,属于苯胺类杀菌剂的一种,甲霜灵可抑制马铃薯晚疫病菌菌丝的生长并导致RNA聚合酶的活性降低,从而能够有效地预防和控制晚疫病的发生,但化学药剂的连续使用易使马铃薯晚疫病菌产生严重的抗药性。1980年,在甲霜灵被用于当地防治马铃薯晚疫病的第二年,荷兰就首先发现了抗甲霜灵的抗性菌株,之后病菌对甲霜灵的抗性日益增加,抗性菌株所占比例在部分地区已达到50%以上,并引起了环境污染和生态平衡的破坏。鉴于目前尚无其它农药完全代替甲霜灵,复合农药中也以甲霜灵为主要成分,因此,对甲霜灵抗性的检测直接影响农药种类的使用及效果。传统测定晚疫病菌对甲霜灵抗药性的方法主要有含药培养基平板法和叶盘法。含药培养基平板法是将不同浓度的甲霜灵制剂与琼脂进行混合制成含药平板,然后在平板上接种致病疫霉,将菌落直径与空白对照菌落直径进行对比,通过计算相对生长率来确定供试菌株对甲霜灵敏感性。叶盘法是将采集到的马铃薯叶片漂浮于盛有甲霜灵药液的培养皿中,接种致病疫霉孢子囊悬浮液进行培养,然后根据叶片上的菌落面积来确定供试菌株对甲霜灵的敏感性。但两种方法都存在一些弊端,叶盘法由于操作过程中完全脱离植物体,不能明确田间染病植株或组织是否存在对甲霜灵的抗性作用,且重复多、工作量大、易染菌;含药平板法准确率高,但是需要种植马铃薯植株,需要经过一个生长阶段,且需要一定的种植条件,例如农田、温室或其它场所等,时间较长、过程也较为复杂。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题是提供一种检测致病疫霉抗药性的方法,以提高实验效率。为解决上述技术问题,本专利技术所采取的技术方案如下。一种检测致病疫霉抗药性的方法,具体包括以下步骤:A.选择实验用马铃薯块茎组织规格;B.配制不同浓度的甲霜灵试剂;C.以上表面滴药法向马铃薯块茎组织上进行甲霜灵试剂的滴加;D.在马铃薯块茎组织上放置活化好的敏感、中抗和高抗的致病疫霉菌饼,20℃黑暗处理5天;E.根据菌丝体在马铃薯块茎组织表面占有的面积以及腐烂程度,确定致病疫霉的抗药性。上述一种检测致病疫霉抗药性的方法,步骤A中用于实验的马铃薯块茎组织规格为2cm×2cm×0.5cm。上述一种检测致病疫霉抗药性的方法,步骤B中测试致病疫霉在马铃薯块茎组织上抗药性的甲霜灵浓度分别为0μg/mL、5μg/mL、50μg/mL。上述一种检测致病疫霉抗药性的方法,步骤E中致病疫霉抗药性的评判标准为菌丝体占马铃薯块茎组织60%-70%时,块茎组织腐烂程度达中度时,所滴加的甲霜灵浓度为其抗性浓度。由于采用了以上技术方案,本专利技术所取得技术进步如下。本专利技术采用的实验用马铃薯块茎容易获得、保存方便、染菌风险低,可随时用于检测,解决了叶盘法检测时脱离马铃薯组织的问题,可以直观反应病菌、马铃薯以及农药之间的相互作用;选择合适浓度的甲霜灵浓度可以真实检测致病疫霉在马铃薯块茎组织上的抗药性;在对抗药性进行确定时,本专利技术通过采用块茎切片表面菌丝体占有的面积和腐烂程度以及不同抗性水平致病疫霉菌株游动孢子释放及孢子囊直接萌发等手段,使结果更加全面、直观、准确。因此本专利技术用于对马铃薯块茎组织进行致病疫霉抗药性检测,与传统方法相比较,准确性为99%以上,检测成本可降低85%,大大提高了检测效率。附图说明图1为本专利技术的流程图;图2为本专利技术采用上表面滴药法向马铃薯块茎滴药时的组织侵染情况;图3为本专利技术采用下表面滴药法向马铃薯块茎滴药时的组织侵染情况;图4为不同类型菌株在0μg/mL甲霜灵浓度时游动孢子释放量;图5为不同类型菌株在5μg/mL甲霜灵浓度时游动孢子释放量;图6为不同类型菌株在50μg/mL甲霜灵浓度时游动孢子释放量。具体实施方式下面将结合附图和具体实施例对本专利技术进行进一步详细说明。一种检测致病疫霉抗药性的方法,其流程图如图1所示,具体包括以下步骤。A.选择实验用马铃薯块茎组织规格,用于实验的马铃薯块茎组织规格为2cm×2cm×0.5cm。本步骤在确定实验用马铃薯块茎组织规格时,将马铃薯块茎切成1cm×1cm×0.5cm、1cm×1cm×1cm、2cm×2cm×0.5cm、2cm×2cm×1cm、3cm×3cm×0.5cm和3cm×3cm×1cm等6个规格的块茎组织,比较不同规格的块茎组织在浸泡混有红色染料的甲霜灵农药后,其侵入组织时间长短及其在侵入药品5天后所引起的块茎组织表面腐烂程度,从而选择实验用最佳马铃薯块茎。甲霜灵侵入时间以马铃薯组织侵入含有红色染料的甲霜灵试剂中为计时起点,以马铃薯组织表面出现红色标记为侵入时间终点。腐烂程度分为三个等级:腐烂面积/马铃薯块茎面积=20%~40%为轻度腐烂,腐烂面积/马铃薯块茎面积=40%~70%为中度腐烂,腐烂面积/马铃薯块茎面积=70%~100%为重度腐烂。实验时,将切割好的马铃薯块茎放入到有红色染料的甲霜灵农药中,浸泡5天后取出,从中间切割,查看中心是否腐烂及腐烂后颜色、气味变化确定腐烂程度,实验结果如表1所示。表1从表1可以看出,规格为1cm×1cm×0.5cm和1cm×1cm×1cm的马铃薯块茎,虽然药品侵入时间相对较短,但块茎腐烂程度为重度,即中心已完全腐烂变为黑色并伴有难闻腐烂气味产生;规格为2cm×2cm×0.5cm、2cm×2cm×1cm、3cm×3cm×0.5cm的马铃薯块茎,块茎腐烂程度为中度,块茎中心出现腐烂迹象,有轻微的腐烂气味产生,但相对比较而言2cm×2cm×0.5cm规格的马铃薯块茎组织侵入时间最短;规格为3cm×3cm×1cm的马铃薯块茎,块茎组织腐烂程度为轻度,中心未出现腐烂迹象,仅在组织外部出现腐烂,但侵入时间相对较长,且相对于之前规格来说,马铃块茎使用多,造成浪费现象。因此选择规格为2cm×2cm×0.5cm的马铃薯块茎作为本专利技术实验方法所需要的对象。B.配制不同浓度的甲霜灵试剂。测试致病疫霉在马铃薯块茎组织上抗药性的甲霜灵浓度分别为0μg/mL、5μg/mL、50μg/mL。本实验中使用的甲霜灵药液的浓度分别为0、5、50μg/mL。先将甲霜灵原药用丙酮配制成2000μg/mL的母液,于4℃冰箱中保存备用,使用时用丙酮稀释至所需浓度即可。C.以上表面滴药法向马铃薯块茎组织上进行甲霜灵试剂的滴加。将确定好浓度的甲霜灵溶液分别采用上表面滴药法和下表面滴药法滴加甲霜灵试剂,三天后,观察其对致病疫霉的拮抗性效果。其中,当甲霜灵药液从马铃薯块茎上表面滴加时,马铃薯晚疫病菌在实验条件下可以侵染马铃薯块茎组织且马铃薯本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种检测致病疫霉抗药性的方法,其特征在于,具体包括以下步骤:A.选择实验用马铃薯块茎组织规格;B.配制不同浓度的甲霜灵试剂;C.以上表面滴药法向马铃薯块茎组织上进行甲霜灵试剂的滴加;D.在马铃薯块茎组织上放置活化好的敏感、中抗和高抗的致病疫霉菌饼,20℃黑暗处理5天;E.根据菌丝体在马铃薯块茎组织表面占有的面积以及腐烂程度,确定致病疫霉的抗药性。

【技术特征摘要】
1.一种检测致病疫霉抗药性的方法,其特征在于,具体包括以下步骤:A.选择实验用马铃薯块茎组织规格;B.配制不同浓度的甲霜灵试剂;C.以上表面滴药法向马铃薯块茎组织上进行甲霜灵试剂的滴加;D.在马铃薯块茎组织上放置活化好的敏感、中抗和高抗的致病疫霉菌饼,20℃黑暗处理5天;E.根据菌丝体在马铃薯块茎组织表面占有的面积以及腐烂程度,确定致病疫霉的抗药性。2.根据权利要求1所述的一种检测致病疫霉抗药性的方法,其特征在于:步骤A中...

【专利技术属性】
技术研发人员:吴艳清蒋继志刘沺沺田荟遥郑奕宸孙尚仪王小竟
申请(专利权)人:保定学院
类型:发明
国别省市:河北,13

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