一种Rho-ROCK信号通路抑制剂Y27632对小鼠卵泡体外发育影响的研究方法技术

本发明专利技术公开了一种Rho‑ROCK信号通路抑制剂Y27632对小鼠卵泡体外发育影响的研究方法，取出生后12天的小鼠卵巢，通过不同分离方法获得腔前卵泡，采用微滴的方式进行卵泡生长和卵母细胞体外成熟培养。实验设置空白对照组和含有Y27632的处理组。采用本发明专利技术的可以获得较为理想的体外培养系统。通过本研究表明，该抑制剂的确可以降低卵泡发育过程中颗粒细胞的凋亡，这为卵泡的继续发育提供了可靠保障。

Study on the effect of Y27632, a Rho-ROCK signaling pathway inhibitor, on the development of mouse follicles in vitro

【技术实现步骤摘要】
一种Rho-ROCK信号通路抑制剂Y27632对小鼠卵泡体外发育影响的研究方法
本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种Rho-ROCK信号通路抑制剂Y27632对小鼠卵泡体外发育影响的研究方法。
技术介绍
卵巢是雌性哺乳动物生殖内分泌功能的器官，其功能的发挥依赖于基本结构功能单位—卵泡。一个完整的卵泡的发育过程主要经历颗粒细胞的包裹和增殖、卵泡膜细胞的出现、卵母细胞的成熟以及性激素调节等过程，根据颗粒细胞的层数大致分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、三级卵泡和成熟卵泡，前三者还没有形成卵泡腔，因此又称为腔前卵泡，后两者则统称为有腔卵泡。在人和动物一个完整的生命周期中，绝大多数的卵泡在腔前阶段都会退化闭锁。如何开发利用并避免生殖资源的浪费，使得卵泡的体外分离、培养甚至冷冻都成为发育生物学中的热点。Rho/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)信号通路是细胞骨架和细胞命运决定关键信号通路之一，能够通过细胞微环境的调节参与细胞的增殖、迁移、分化和凋亡。该信号通路抑制剂Y27632通过与ATP竞争结合催化位点时限抑制胚胎干细胞的凋亡，而且对胚胎发生过程中，能够通过TGF-β和SMAD信号通路抑制内胚层细胞的分化，而改善中、外胚层细胞的分化能力。该条信号通路通过对颗粒细胞的增殖对腔前卵泡的发育起到一定的调节作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出了一种Rho-ROCK信号通路抑制剂Y27632对小鼠卵泡体外发育影响的研究方法。通过较为成熟小鼠腔前卵泡体外培养体系中添加Y27632，探讨其对颗粒细胞的增殖和卵母细胞发育的影响。为影响卵泡发育的分子机制提供新思路。其技术方案如下：一种Rho-ROCK信号通路抑制剂Y27632对小鼠卵泡体外发育影响的研究方法，包括以下步骤：步骤1、小鼠腔前卵泡的分离：体视镜下获得小鼠卵巢，在超净工作台内，用分离液清洗3次后，机械分离法：将卵巢转移到含有2mL分离液的玻璃表面皿中，用解剖针在体视显微镜下钝性分离卵泡，保证单侧卵巢卵泡体外分离的时间不要超过30min。用培养液清洗三次后，检出形态完整、直径在100～130μm的卵泡。酶法：直接将卵巢放入消化液玻璃凹皿中，于37℃培养1h后，去掉消化液中的组织块，加入卵泡培养液低速离心5min中后弃上清，再用培养液清洗两次后，检出形态完整的腔前卵泡进行培养。酶法-机械法：用消化液处理20min后，再采用上述机械法的分离方法。步骤2、腔前卵泡的培养：选用直径为60mm的培养皿，提前12h准备30μL升的卵泡培养液液滴，并在上面覆盖2mL矿物油。用自制玻璃口吸管将分离获得的腔前卵泡放入液滴中(1枚/个)于37℃培养箱培养，每2d半量换液，并收集培养液上清。步骤3、卵泡RNA的提取、cDNA反转录及荧光定量PCR：收集5个培养前及培养后2d、4d、6d和8d的小鼠卵泡，在PBS中清洗3遍后，严格按照微量RNA提取试剂盒的说明书操作，用微量分光光度计检测符合标准的RNA样品可按照反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒进行相关基因的检测。将结果输入Graphpadprism软件进行分析和制图。步骤4、卵泡活性检测：为评估并确定卵泡的存活率，按不同天数挑出的发育中的卵泡用荧光试剂CalceinAM和Eethidiumhomodimer(EthD-1)在黑暗条件下进染色中，在37℃培养箱中放置15min，然后在荧光显微镜下观察卵泡的活性。其中EthD-1可进入已发生细胞膜破损或凋亡的细胞中，发出明亮的红色荧光。根据颗粒细胞和卵母细胞都发出红光的比例判断卵泡的存活状态。步骤5、卵泡和卵母细胞的测量：换液后，在倒置显微镜下观察卵泡的发育情况并拍照，用ImageJ软件测量卵泡和卵母细胞的长轴和短轴直径，并且平均值作为卵泡和卵母细胞的直径，同时记录卵泡的存活情况。当观察到卵泡的卵母细胞和/或颗粒细胞颜色变暗，在显微镜下没有折光性时，则判断为卵泡已发生死亡。步骤6、统计学方法结果采用SPSS21.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示。各组间采用单因素方差分析比较。P≤0.05为差异有统计学意义。进一步，步骤1中，所述分离液的成分为：L-15培养基+10％FBS+1％青/链霉素。进一步，步骤1中，所述消化液的成分为：1mg/mL的胶原酶+0.1g/mLDNase。进一步，所述卵泡生长培养液的成分为：α-MEM培养基+3％BSA+1％ITS+1％青/链霉素,0.5IU/mLFSH+0.23mMPNa+50g/mlVc。进一步，卵母细胞成熟液的成分为：卵泡生长培养液+1.5IU/mLHCG+10ng/mLEGF本专利技术的有益效果为：本专利技术的研究结果显示，采用本专利技术的可以获得较为理想的体外培养系统。通过本研究表明，该抑制剂的确可以降低卵泡发育过程中颗粒细胞的凋亡，这为卵泡的继续发育提供了可靠保障。附图说明图1是不同分离方法下卵泡培养后的形态，其中，图1A:酶消化法培养5天的卵泡；图1B:酶结合机械法培养6天的卵泡；图1C:酶法培养6天的卵泡，卵母细胞发生外溢；图1D:机械法培养8天的卵泡，卵母细胞排出第一极体。图中箭头所示为透明带，五角星所示为第一极体，标尺大小为50微米；图2是Y27632对颗粒细胞和卵母细胞发育的影响，其中，图2A:实时荧光定量检测颗粒细胞(Amh,Lhr,Fshr和Foxl2)和卵母细胞基因(Bmp15)的表达情况。*P＜0.05，**P＜0.001与对照组比较；图2B:免疫荧光检测卵母细胞成熟后纺锤体微管(α-tublin)的分布；图3A:卵泡培养6天后的活力检测；图3B:荧光定量检测卵泡中凋亡相关基因Bad和凋亡抑制基因Xiap的表达；*P＜0.05，**P＜0.001与对照组比较。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术的技术方案作进一步详细地说明。通过机械法、酶(胶原酶)消化法以及两者结合的方式，对小鼠腔前卵泡进行分离，经统计发现，通过机械法(取得卵巢后，单侧卵巢保证在半小时内将卵泡分离出来)获得的卵母细胞数量最多，裸卵数量最少(表1)。表1不同分离方法获得的卵泡和卵母细胞数(x±s)Table1Thecountofsinglefollicleanddenudedoocyteatdifferentmethod如图1所示，卵泡培养后，无论是酶法还是酶-机械法，都会造成卵泡膜不同程度的破损，使颗粒细胞发生外溢(图1A和图1B)，导致卵泡不能正常发育，卵母细胞提前释放。与机械法相比，这种卵母细胞的透明带也较薄(图1C)，难以发育成腔，但通过机械法，能够获得卵泡基底膜和颗粒细胞较为完整的卵泡，培养后期经激素处理后，能够释放第一极体，提示卵泡完成第一次减数分裂(图1D)。将采用机械法获得的单个卵泡用30微升的液滴培养，发现添加Rock抑制剂Y-27632后，对卵泡和卵母细胞的增长直径(表2和表3)无明显的增长或抑制作用。表2不同处理组卵泡的直径(x±s)Table2Thediameteroffollicleindifferenttreatment.表3不同处理组卵母细胞的直径(x±s)Table3Thediameterofoocyteindifferenttreatment.进一步采用实时荧光定量的方法，对颗粒细胞和卵本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Rho‑ROCK信号通路抑制剂Y27632对小鼠卵泡体外发育影响的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、小鼠腔前卵泡的分离：体视镜下获得小鼠卵巢，在超净工作台内，用分离液清洗3次后，机械分离法：将卵巢转移到含有2mL分离液的玻璃表面皿中，用解剖针在体视显微镜下钝性分离卵泡，保证单侧卵巢卵泡体外分离的时间不要超过30min；用培养液清洗三次后，检出形态完整、直径在100～130μm的卵泡；酶法：直接将卵巢放入消化液玻璃凹皿中，于37℃培养1h后，去掉消化液中的组织块，加入卵泡培养液低速离心5min中后弃上清，再用培养液清洗两次后，检出形态完整的腔前卵泡进行培养；酶法‑机械法：用消化液处理20min后，再采用上述机械法的分离方法；步骤2、腔前卵泡的培养：选用直径为60mm的培养皿，提前12h准备30μL升的卵泡培养液液滴，并在上面覆盖2mL矿物油；用自制玻璃口吸管将分离获得的腔前卵泡放入液滴中于37℃培养箱培养，每2d半量换液，并收集培养液上清；步骤3、卵泡RNA的提取、cDNA反转录及荧光定量PCR：收集5个培养前及培养后2d、4d、6d和8d的小鼠卵泡，在PBS中清洗3遍后，严格按照微量RNA提取试剂盒的说明书操作，用微量分光光度计检测符合标准的RNA样品按照反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒进行相关基因的检测；将结果输入Graphpad prism软件进行分析和制图；步骤4、卵泡活性检测：为评估并确定卵泡的存活率，按不同天数挑出的发育中的卵泡用荧光试剂Calcein AM和EthD‑1在黑暗条件下进染色中，在37℃培养箱中放置15min，然后在荧光显微镜下观察卵泡的活性；其中EthD‑1进入已发生细胞膜破损或凋亡的细胞中，发出明亮的红色荧光；根据颗粒细胞和卵母细胞都发出红光的比例判断卵泡的存活状态；步骤5、卵泡和卵母细胞的测量：换液后，在倒置显微镜下观察卵泡的发育情况并拍照，用ImageJ软件测量卵泡和卵母细胞的长轴和短轴直径，并且平均值作为卵泡和卵母细胞的直径，同时记录卵泡的存活情况；当观察到卵泡的卵母细胞和/或颗粒细胞颜色变暗，在显微镜下没有折光性时，则判断为卵泡已发生死亡；步骤6、统计学方法结果采用SPSS21.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示；各组间采用单因素方差分析比较；P≤0.05为差异有统计学意义。...

【技术特征摘要】
1.一种Rho-ROCK信号通路抑制剂Y27632对小鼠卵泡体外发育影响的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、小鼠腔前卵泡的分离：体视镜下获得小鼠卵巢，在超净工作台内，用分离液清洗3次后，机械分离法：将卵巢转移到含有2mL分离液的玻璃表面皿中，用解剖针在体视显微镜下钝性分离卵泡，保证单侧卵巢卵泡体外分离的时间不要超过30min；用培养液清洗三次后，检出形态完整、直径在100～130μm的卵泡；酶法：直接将卵巢放入消化液玻璃凹皿中，于37℃培养1h后，去掉消化液中的组织块，加入卵泡培养液低速离心5min中后弃上清，再用培养液清洗两次后，检出形态完整的腔前卵泡进行培养；酶法-机械法：用消化液处理20min后，再采用上述机械法的分离方法；步骤2、腔前卵泡的培养：选用直径为60mm的培养皿，提前12h准备30μL升的卵泡培养液液滴，并在上面覆盖2mL矿物油；用自制玻璃口吸管将分离获得的腔前卵泡放入液滴中于37℃培养箱培养，每2d半量换液，并收集培养液上清；步骤3、卵泡RNA的提取、cDNA反转录及荧光定量PCR：收集5个培养前及培养后2d、4d、6d和8d的小鼠卵泡，在PBS中清洗3遍后，严格按照微量RNA提取试剂盒的说明书操作，用微量分光光度计检测符合标准的RNA样品按照反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒进行相关基因的检测；将结果输入Graphpadprism软件进行分析和制图；步骤4、卵泡活性检测：为评估并确定卵泡的存活率，按不同天数挑出的发育中的卵泡用荧光试剂CalceinAM和E...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞晓丽，蒲静，刘心蕊，罗晓强，邱意开，张樱馨，王翔，裴秀英，
申请(专利权)人：宁夏医科大学，
类型：发明
国别省市：宁夏,64