一种由凡纳滨对虾提取吲哚二萜类化合物的方法技术

本发明专利技术提供一种由凡纳滨对虾提取吲哚二萜类化合物的方法，属于生物技术领域，该方法是从凡纳滨对虾中分离出真菌菌株黄曲霉OUCMDZ‑2205并进行培养和收集，然后将菌株接种至发酵液中进行变温发酵培养，再对发酵液进行有机提取，最后层析纯化所得提取物，可得吲哚二萜类化合物；上述吲哚二萜类化合物可用于抗菌抑菌和抗癌领域。本发明专利技术提供的由凡纳滨对虾提取吲哚二萜类化合物的方法能降低体系电平衡能阈值和基质干扰，提升化合物检出量和产率，富集倍数和萃取效率高，同时能激活并提高凡纳滨对虾中微生物沉默基因的表达，增加微生物代谢产物的化学多样性和流通效率，降低提取难度和提取剂用量，提高生产效率。

A Method for Extracting Indole Diterpenoids from Litopenaeus vannamei

【技术实现步骤摘要】
一种由凡纳滨对虾提取吲哚二萜类化合物的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种由凡纳滨对虾提取吲哚二萜类化合物的方法。
技术介绍
凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)，又称南美白对虾(WhitePrawn)，别名白脚虾、凡纳对虾，原产国家厄瓜多尔，原产地中南美太平洋海岸水域，生长气候带热带、亚热带、暖温带、温带海域，分布于太平洋西海岸至墨西哥湾中部，生命周期一年。黄曲霉，半知菌类，一种常见腐生真菌。多见于发霉的粮食、粮制品及其它霉腐的有机物上。菌落生长较快，结构疏松，表面灰绿色，背面无色或略呈褐色。菌体有许多复杂的分枝菌丝构成。营养菌丝具有分隔；气生菌丝的一部分形成长而粗糙的分生孢子梗，顶端产生烧瓶形或近球形顶囊，表面产生许多小梗(一般为双层)，小梗上着生成串的表面粗糙的球形分生孢子。分生孢子梗、顶囊、小梗和分生孢子合成孢子头，可用于产生淀粉酶、蛋白酶和磷酸二酯酶等，也是酿造工业中的常见菌种。众所周知，微生物早已成为抗生素、酶抑制剂等活性物质的重要来源。微生物由于可以大规模发酵培养，无原料限制，不会破坏环境等优点已成为天然产物研究领域的热点。近年来从陆地微生物中获得新化合物的概率大幅降低，而海洋来源微生物由于其生存环境特异，除可产生与陆地相似的代谢产物之外，有时还会产生一些结构特异的新化合物，显示了巨大的开发利用前景。曲霉属真菌一直以来都是天然产物界研究的重要菌种其次级代谢产物结构新颖骨架多变，除了常规的甾体，倍半萜，蒽醌等常见结构类型以外，往往还含有：生物碱类，肽类、聚酮类、二倍半萜等多种的骨架。这些结构新颖的化合物往往还含有细胞毒，抗菌，抗病毒等多种活性，成为海洋药物先导化合物的重要来源之一，引起了业内学者的广泛关注。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能降低体系电平衡能阈值和基质干扰，提升化合物检出量和产率，富集倍数和萃取效率高的由凡纳滨对虾提取吲哚二萜类化合物的方法，该方法能激活并提高凡纳滨对虾中微生物沉默基因的表达，增加微生物代谢产物的化学多样性和流通效率，降低提取难度和提取剂用量，提高生产效率。本专利技术为实现上述目的所采取的技术方案为：一种由凡纳滨对虾提取吲哚二萜类化合物的方法，其中吲哚二萜类化合物是从凡纳滨对虾中分离出的真菌菌株黄曲霉OUCMDZ-2205经培养、变温发酵、提取和纯化所得提取物；上述吲哚二萜类化合物包括具有结构式如下式(1)的化合物：其中，R1结构如下式(2)所示：R2＝H。从海洋资源中获取微生物，并对变温发酵产物进行纯化、分离和鉴定，提高菌株次生代谢产物的化学多样性和新化合物发现几率，并对分离所得化合物进行生理活性检测，以此获得在抗菌抑菌和抗癌领域具有应用前景的吲哚二萜类化合物。作为优选，培养步骤如下：将对虾依次用乙醇和无菌海水洗涤后捣碎，然后用无菌海水稀释至10-2，取100～200μl稀释液均匀涂布在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，于25～30℃下培养5～8天后，收集并纯化菌落，于0～4℃储存备用。海洋来源的微生物由于其生存环境特异，有时会产生一些结构特异新颖的化合物，而曲霉属真菌的次级代谢产物结构新颖骨架多变，除了常规的甾体、倍半萜、蒽醌等常见结构类型以外，往往还含有生物碱类，肽类、聚酮类、二倍半萜等多种的骨架，具有良好的开发利用前景。作为优选，发酵步骤如下：将培养所得黄曲霉菌种以6～12％的接种量培养在含有4-苯基丁酸和莽草酸的发酵培养液中，静态条件下培育25～35天，即得发酵液。发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反应的专一性强，因而可以得到较为单—的代谢产物，同时在微生物最适宜条件下发酵，避免了海洋环境中存在的高压、高盐、寡营养等负面影响，能提高菌株代谢产物的多样性，有利于筛选和分离。作为优选，发酵培育温度以先高温后低温的方式控制，高温温度为23～30℃，持续时间为15～20天，低温温度为12～17℃，持续至发酵结束。发酵采用先高温后低温的方式进行，一方面发酵后期由于微生物前期生长产生的生理温较多，且散热困难，对微生物生长产生抑制或直接造成死亡，降温后有利于延长微生物生长期，从而产生更多初级及次生代谢产物，另一方面后期降至低温后，微生物为维持生理活性，细胞内容物不断收缩，加快了细胞中水分蒸发，造成细胞失重而破坏其完整性，细胞通透性增加，使得培养液中众多杂原子进入细胞内参与生物合成，杂原子形成不同极性中心，而增加了代谢产物的多样性和发现新化合物的几率，同时也降低提取难度和提取剂用量，提高生产效率。进一步优选，4-苯基丁酸和莽草酸在发酵培养液中的含量分别为0.05～0.15mM和0.03～0.08mM。4-苯基丁酸和莽草酸以此特殊比例加入发酵液中，首先可有效激活和提高菌株在原生环境中部分沉默基因的表达，使得多种代谢途径被激活，从而提高菌株次生代谢产物的化学多样性，其次能参与氨基酸脱氢的反应，抑制脱氢酶内部键间聚集，将脱氢酶凹型构造中的活性位点暴露出来，以此提高氨基酸脱氢中间产物在竞争途径中的含量，从而增加代谢产物流通效率。作为优选，提取是用乙酸乙酯对发酵液过滤所得滤液和菌丝分别进行萃取，其中菌丝提取需在丙酮溶液保护下进行。进一步优选，丙酮溶液的体积浓度为70～80％。丙酮溶液能在减压条件下浓缩后，使菌丝能承受乙酸乙酯有机溶剂的萃取，对菌丝有提取和保护的作用，进而得到菌丝萃取液。作为优选，纯化是依次用硅胶柱真空液相层析、SphadexLH-20凝胶柱层析和半制备HPLC纯化提取所得粗提物。进一步优选，硅胶柱真空液相层析用石油醚-CH2Cl2(1:1和0:1)和CH2Cl2-甲醇(100～0％)梯度洗脱；SphadexLH-20凝胶柱层析用1:1的CH2Cl2-甲醇洗脱；半制备HPLC用浓度为90％甲醇溶液洗脱。作为优选，吲哚二萜类化合物在抗菌抑菌和抗癌领域的用途。所得吲哚二萜类化合物为白色无定形粉末，分子式为C32H39NO3，并表现出对金黄色葡萄球菌的抗菌活性且最小抑菌浓度值为20.5μM，同时可以对A549细胞和激酶蛋白C-β产生抑制作用，可作为抗癌药物开发的潜在靶点化合物，因此在抗菌抑菌和抗癌领域具有应用前景。本专利技术的有益效果为：1)本专利技术采用海洋来源的微生物进行化合物的发酵培育，利用发酵温度先高温后低温的方式，延长微生物生长期，同时利用细胞失重而破坏其完整性，使得细胞通透性增加，使得杂原子参与生物合成并形成不同极性中心，增加了代谢产物的多样性和产量，同时也降低提取难度和提取剂用量，提高生产效率；2)本专利技术中通过向发酵培养液中添加具有增益效果的物质，激活和提高菌株中部分沉默基因的表达，从而提高菌株次生代谢产物的化学多样性和新化合物发现几率，其次提高氨基酸脱氢中间产物在竞争途径中的含量，从而增加代谢产物流通效率；3)本专利技术中利用有机提取和多次层析纯化的方法，将目标化合物进行分离和提纯，目标物在提取溶剂中选择性和富集倍数增加，目标物萃取效率和收率显著提高，且目标物检测痕量最低值降低，提升了化合物检出量和产率；4)本专利技术中所得吲哚二萜类化合物表现出对金黄色葡萄球菌的抗菌活性，同时可以对A549细胞和激酶蛋白C-β产生抑制作用，可作为抗癌药物开发的潜在靶点化合物，在抗菌抑菌和抗癌领域具有应用前景。本专利技术采用了上述技术方案提供一种由凡纳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种由凡纳滨对虾提取吲哚二萜类化合物的方法，其特征在于：吲哚二萜类化合物是从凡纳滨对虾中分离出的真菌菌株黄曲霉OUCMDZ‑2205经培养、变温发酵、提取和纯化所得提取物；所述吲哚二萜类化合物包括具有结构式如下式(1)的化合物：

【技术特征摘要】
1.一种由凡纳滨对虾提取吲哚二萜类化合物的方法，其特征在于：吲哚二萜类化合物是从凡纳滨对虾中分离出的真菌菌株黄曲霉OUCMDZ-2205经培养、变温发酵、提取和纯化所得提取物；所述吲哚二萜类化合物包括具有结构式如下式(1)的化合物：其中，R1结构如下式(2)所示：R2＝H。2.根据权利要求1所述的一种由凡纳滨对虾提取吲哚二萜类化合物的方法，其特征在于：所述培养步骤如下：将对虾依次用乙醇和无菌海水洗涤后捣碎，然后用无菌海水稀释至10-2，取100～200μl稀释液均匀涂布在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，于25～30℃下培养5～8天后，收集并纯化菌落，于0～4℃储存备用。3.根据权利要求1所述的一种由凡纳滨对虾提取吲哚二萜类化合物的方法，其特征在于：所述发酵步骤如下：将培养所得黄曲霉菌种以6～12％的接种量培养在含有4-苯基丁酸和莽草酸的发酵培养液中，静态条件下培育25～35天，即得发酵液。4.根据权利要求1或3所述的一种由凡纳滨对虾提取吲哚二萜类化合物的方法，其特征在于：所述发酵培育温度以先高温后低温的方式控制，高温温度为23～30℃，持续时间为15～20天，低温温度为12～17℃，持续至发酵结束。5.根据权利要求3所述的一种由凡纳滨对虾提...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙坤来，张译文，宫凯凯，赵成英，
申请(专利权)人：嘉兴市爵拓科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33