一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针，所述单链胶原多肽功能探针中间含有数个(Gly‑Pro‑Hyp)n、(Gly‑Pro‑Pro)n或(Gly‑Hyp‑Hyp)n重复序列；多肽序列连接修饰功能物质；多肽序列在C端包含数个带电荷的氨基酸。制备方法包括，树脂溶胀；氨基酸活化；氨基酸缩合反应；氨基脱保护；延伸肽树脂；合成目标序列的胶原多肽后，向反应器中加入20‑30％乙酸酐,然后将功能物质连接到该胶原多肽上；切割树脂；胶原多肽的分离纯化。本发明专利技术公开的单链胶原多肽功能探针，无需加热或光照等预处理，完全避免了损伤正常组织的潜在风险；对病变胶原蛋白具有良好的靶向识别能力、特异性好、结合能力强；检测快速、操作简单、使用方便；探针水溶性好、无生物毒性。

A Charge Exclusion Induced Single Chain Collagen Polypeptide Functional Probe and Its Preparation Method

【技术实现步骤摘要】
一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针及其制备方法
本专利技术属于生物检测
，尤其是涉及一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针及其制备方法。
技术介绍
靶向识别是实现肿瘤等疾病的早期检测和精确诊断的关键技术，在生物医学领域应用广泛。作为细胞外基质的主要成分和人体中含量最丰富的蛋白质，胶原蛋白形成一个分子支架,为皮肤、骨骼、肌腱等结缔组织提供机械强度和结构完整性。胶原蛋白同时参与调控细胞的增殖、分化和迁移等基本生命活动，并与成骨不全症、关节炎、肿瘤等重大疾病息息相关。因此，胶原蛋白是人体众多疾病的关键生物标记物，实现对胶原蛋白的靶向检测对这些疾病的早期诊断和治疗至关重要。胶原蛋白的靶向识别传统上依赖于组织染色方法，包括HE染色法、V.G染色法和Masson染色法等。这些方法可以实现胶原纤维染色，但是，它们通常步骤复杂，染色过程对组织具有破坏性，染色之后的组织不易用于其它染色。更为重要的是，这些染色方法不能区分正常的胶原蛋白和发生病变的胶原蛋白，它们对所有的胶原蛋白同时进行染色。事实上，只有病变的胶原蛋白才是真正的疾病标记物，而目前的胶原蛋白染色方法不具备这样的特异性。胶原蛋白具有独特的三重螺旋结构，而在病理条件下，它被特异性蛋白酶降解并形成部分解折叠结构。目前，已研发出靶向多肽和抗体用于胶原蛋白的识别及成像，但是，这些检测方法存在对病变胶原蛋白无特异性、样品需要组织封闭，多肽探针需要加热或紫外照射等可能造成正常胶原蛋白损伤的预处理，探针结合能力弱，操作复杂等缺陷。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种利用特定序列的胶原多肽可以特异性的结合部分解链的胶原蛋白，同时在胶原多肽中引入富含带电氨基酸的序列降低胶原多肽的三重螺旋结构稳定性，使探针具有在室温和生理pH下无需加热或紫外预处理即能保持对病变胶原蛋白的特异性结合能力。为了解决上述技术问题，本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针，所述单链胶原多肽功能探针中间含有数个(Gly-Pro-Hyp)n、(Gly-Pro-Pro)n或(Gly-Hyp-Hyp)n重复序列；多肽序列连接修饰功能物质；多肽序列在C端包含数个带电荷的氨基酸，以促使多肽保持单链非折叠结构。作为优选，所述胶原多肽探针的序列为X-(Gly-Pro-Hyp)a-Z(a为4-20之间的整数)，X-(Gly-Pro-Pro)a-Z(a为4-20之间的整数)，X-(Gly-Hyp-Hyp)a-Z(a为4-20之间的整数)，(Gly-Pro-Hyp)a-Gly-Pro-Amp(-X)-(Gly-Pro-Hyp)b-Z(a和b为1-20之间的整数)、(Gly-Pro-Pro)a-Gly-Pro-Amp(-X)-(Gly-Pro-Pro)b-Z(a和b为1-20之间的整数)或(Gly-Hyp-Hyp)a-Gly-Pro-Amp(-X)-(Gly-Hyp-Hyp)b-Z(a和b为1-20之间的整数)中的一种；其中X为功能物质，Gly为甘氨酸，Pro为脯氨酸，Hyp为羟脯氨酸，Amp为4-氨基脯氨酸,Z为富含带电荷氨基酸的序列。作为优选，所述功能物质为荧光素类分子、香豆素类分子、罗丹明类分子、菁染料类分子、BODIPY类分子、方酸类分子、磷光分子、半导体量子点、碳量子点、硅量子点、硫量子点、磷量子点、钙钛矿量子点、贵金属团簇、上转化稀土纳米材料、长余辉纳米材料、石墨烯、氧化石墨烯、二硫化钼、二硫化钨、二氧化锰、氮化硼、碳纳米管、四氧化三铁纳米粒子、氧化铁纳米粒子、硅纳米粒子、贵金属纳米粒子、MOF材料、硅球、脂质体和磁珠中的一种或几种；所述功能物质连接在胶原多肽的N端，或通过胶原多肽某一中间位置的Amp(4-氨基脯氨酸)的侧链连接。作为优选，所述C端富含带电荷氨基酸的序列包含1～15个相同或不同的带电荷的氨基酸或氨基酸带电衍生物。作为优选，所述单链胶原多肽功能探针中间含有1～15个(Gly-Pro-Hyp)n、(Gly-Pro-Pro)n或(Gly-Hyp-Hyp)n重复序列。电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针的制备方法，包括以下步骤，a)将80-250mg的树脂加入具有筛板的反应器中，使用2-8mL二氯甲烷溶胀树脂；b)由15-25%哌啶/N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液脱除N端Fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度；c)将N端由Fmoc保护的氨基酸（4eq）与HOBt（4eq）和HBTU（4eq）由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA（6eq），溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1-6hrs；d)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由2-8mLDMF和DCM洗2-4次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由15-25%哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min，树脂分别由5mLDMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；e)之后重复步骤c)和d），直到合成目标序列的胶原多肽后，然后向反应器中加入20-30%乙酸酐，显色反应检测反应完全后，树脂分别由3-8mLDMF和DCM洗2-4次；f)称取功能物质（4eq）、HOBt（4eq）和HBTU（4eq），由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA（4-10eq），混合液加入到多肽溶液中，避光反应12-48hrs；或称螯合物质（4eq）、HOBt（4eq）和HBTU（4eq），由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA（4-10eq），混合液加入到多肽溶液中，避光反应12-48hrs；g)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤2-5次，然后将树脂抽干，加入切割液，切割液的组分为TFA:TIS:水的质量比为95:2.5:2.5，反应1-6hrs；h)向反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀，然后通过离心收集沉淀，用TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2-4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽；i)螯合物修饰肽溶解于缓冲液中，加入到缓冲液溶解的金属纳米功能物质中，肽：功能物质=1：100。反应2-12hrs；j)将反应液于缓冲液中透析24-48hrs。与现有技术相比，本专利技术的有益之处是：1.无需加热或光照等预处理，完全避免了损伤正常组织的潜在风险；2.对病变胶原蛋白具有良好的靶向识别能力、特异性好、结合能力强；3.检测快速、操作简单、使用方便4.探针水溶性好、无生物毒性。附图说明：下面结合附图对本专利技术进一步说明。图1是电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针靶向检测病变胶原蛋白的示意图；图2为本专利技术(Gly-Pro-Hyp)7-Asp6的热变曲线及一阶导数图；图3为本专利技术的大鼠尾巴组织、耳朵组织和膀胱组织染色的荧光显微镜图；图4为本专利技术的大鼠皮肤烫伤和大鼠正常组织的荧光显微镜图；图5为本专利技术的大鼠不同部位损伤组织的荧光显微镜图；图6为本专利技术的人病理切片组织的荧光显微镜图；图7为本专利技术的去细胞化大鼠尾巴组织荧光染色显微镜图。具体实施方式：下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细描述：实施例1（1）胶原多肽探针的设计设计的胶原多肽序列为6-Rox-Ahx-(Gly-Pro-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针，其特征在于：所述单链胶原多肽功能探针中间含有数个(Gly‑Pro‑Hyp)n、(Gly‑Pro‑Pro)n或(Gly‑Hyp‑Hyp)n重复序列；多肽序列连接修饰功能物质；多肽序列在C端包含数个带电荷的氨基酸，以促使多肽保持单链非折叠结构。

【技术特征摘要】
1.一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针，其特征在于：所述单链胶原多肽功能探针中间含有数个(Gly-Pro-Hyp)n、(Gly-Pro-Pro)n或(Gly-Hyp-Hyp)n重复序列；多肽序列连接修饰功能物质；多肽序列在C端包含数个带电荷的氨基酸，以促使多肽保持单链非折叠结构。2.根据权利要求1所述的电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针，其特征在于：所述胶原多肽探针的序列为X-(Gly-Pro-Hyp)a-Z(a为4-20之间的整数)，X-(Gly-Pro-Pro)a-Z(a为4-20之间的整数)，X-(Gly-Hyp-Hyp)a-Z(a为4-20之间的整数)，(Gly-Pro-Hyp)a-Gly-Pro-Amp(-X)-(Gly-Pro-Hyp)b-Z(a和b为1-20之间的整数)、(Gly-Pro-Pro)a-Gly-Pro-Amp(-X)-(Gly-Pro-Pro)b-Z(a和b为1-20之间的整数)或(Gly-Hyp-Hyp)a-Gly-Pro-Amp(-X)-(Gly-Hyp-Hyp)b-Z(a和b为1-20之间的整数)中的一种；其中X为功能物质，Gly为甘氨酸，Pro为脯氨酸，Hyp为羟脯氨酸，Amp为4-氨基脯氨酸,Z为富含带电荷氨基酸的序列。3.根据权利要求2所述的电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针，其特征在于：所述功能物质为荧光素类分子、香豆素类分子、罗丹明类分子、菁染料类分子、BODIPY类分子、方酸类分子、磷光分子、半导体量子点、碳量子点、硅量子点、硫量子点、磷量子点、钙钛矿量子点、贵金属团簇、上转化稀土纳米材料、长余辉纳米材料、石墨烯、氧化石墨烯、二硫化钼、二硫化钨、二氧化锰、氮化硼、碳纳米管、四氧化三铁纳米粒子、氧化铁纳米粒子、硅纳米粒子、贵金属纳米粒子、MOF材料、硅球、脂质体和磁珠中的一种或几种；所述功能物质连接在胶原多肽的N端，或通过胶原多肽某一中间位置的Amp(4-氨基脯氨酸)的侧链连接。4.根据权利要求1所述的电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针，其特征在于：所述C端富含带电荷氨基酸的序列包含1～15个相同或不同的带电荷的氨基酸或氨基酸带电衍生物。5.根据权利要求1所述的电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针，其特征在于：所述单链胶原多肽功能探针中间含有1...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖建喜，蔡向东，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62