一种重组荞麦防御素蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物技术和医药保健品领域，提供了一种重组荞麦防御素蛋白及其制备方法和应用，所示重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，其氨基酸分子量为6.3kDa，等电点8.5；该重组荞麦防御素蛋白具有抗真菌作用，在医疗保健，食品开发和化妆品研发等方面具有实用价值。

A Recombinant Buckwheat defensin protein and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种重组荞麦防御素蛋白及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物技术和医药保健品领域，具体涉及一种重组荞麦防御素(recombinantbuckwheatdefensin)蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
真菌型疾病对植物，动物和人类产生巨大影响。它们会破坏农作物，威胁野生动物的灭绝并且可以杀死更容易受到真菌感染的免疫功能低下的人群。所有生物在进化过程中都有相应策略来逃避病原体的感染。植物具有许多独特的防御机制，包括病原体入侵的物理屏障以及广泛的次级代谢产物和抗菌肽(antimicrobialpeptides，简称AMP)。植物AMP包括硫素，脂质转移蛋白，橡胶素，打结素，富含甘氨酸的肽，MBP-1(来自玉米的AMP)的同源物，蜕皮素，环肽，蛋白酶抑制剂(PI)和防御素。植物中的AMP通常在种子和生殖组织中表达，并且还受到干旱，盐，冷，病原体入侵或伤害诱导的应激的上调，可抑制杀死多种病原真菌，因此可用来研制新型的杀菌剂或新型的抗生素类药物。植物防御素是植物先天免疫系统的主要成分。通常，它们对哺乳动物或植物细胞无毒。然而，它们对植物和人类的真菌病原体具有极高的活性。植物防御素是在种子中常见的小的阳离子蛋白质，但也位于植物的其他部分，包括叶，根，树皮，豆荚，块茎，果实和花器官。它们集中在表皮细胞和气孔细胞中，产生于可能是与病原体接触的初始点。植物防御素由45-54个氨基酸残基组成，并通过四个二硫键保持在一起。这些二硫键使得分子对蛋白酶和极端的pH和温度高度稳定。八个高度保守的半胱氨酸的间距和连接性定义了植物防御素家族。基于以上研究背景，由于真菌防御素具有高度稳定性，良好的水溶性、安全无毒、且抑菌谱广、具备保健作用的特点，但在生物体中含量低，难以天然提取，而化学合成方法成本高，无法满足工业化生产的需求，因此，借助于基因工程与蛋白质工程手段是大规模生产防御素的一条经济有效的途径。
技术实现思路
基于上述现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种重组荞麦防御素蛋白及其制备方法和应用，通过构建荞麦防御素蛋白的重组表达载体，利用重组表达技术获得重组荞麦防御素蛋白，该蛋白对真菌有抑菌活性，生产及纯化方法简单，在医疗保健、食品开发和化妆品研发等方面具有实用价值。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一方面，本专利技术提供的一种重组荞麦防御素蛋白，该蛋白含有75个氨基酸，预测的信号肽序列为前端18个氨基酸残基，理论分子量为6.3kDa，等电点为8.5。所述重组荞麦防御素蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示；其中，SEQIDNO：1所示的氨基酸序列如下：MEKKVLGLLLFIIVFASGIGTHMVEVEGKTCTKPSKYYHGWCVAGCGGACKKENWPQGDCEGYGFKSHCVCKRPC。去除前端18个氨基酸后的重组荞麦防御素蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；其中，SEQIDNO.2所示的氨基酸序列如下：IGTHMVEVEGKTCTKPSKYYHGWCVAGCGGACKKENWPQGDCEGYGFKSHCVCKRPC。另一方面，本专利技术还提供了一种DNA片段，其包含编码如上所述的重组荞麦防御素蛋白的核苷酸序列。根据本专利技术，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。所述SEQIDNO.3表示的核苷酸序列如下：ATGGAGAAAAAAGTTTTGGGTCTTCTTCTCTTCATCATCGTGTTTGCTTCAGGGATAGGAACACATATGGTAGAGGTGGAGGGGAAAACATGCACAAAGCCAAGCAAGTACTACCACGGATGGTGTGTTGCAGGCTGCGGCGGAGCTTGCAAGAAGGAGAATTGGCCTCAGGGCGATTGCGAAGGCTACGGCTTCAAGTCCCATTGTGTTTGCAAAAGGCCGTGT。去除前端18个氨基酸后，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，所述SEQIDNO.4表示的核苷酸序列为：ATAGGAACACATATGGTAGAGGTGGAGGGGAAAACATGCACAAAGCCAAGCAAGTACTACCACGGATGGTGTGTTGCAGGCTGCGGCGGAGCTTGCAAGAAGGAGAATTGGCCTCAGGGCGATTGCGAAGGCTACGGCTTCAAGTCCCATTGTGTTTGCAAAAGGCCGTGT。进一步的，本专利技术还提供了一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的如上所述的DNA片段。进一步的，本专利技术还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的表达载体。进一步的，本专利技术还提供了一种如上所述的重组荞麦防御素蛋白的制备方法，包括以下步骤：1)通过分析荞麦全基因序列筛选获得荞麦防御素蛋白的编码基因；2)根据荞麦防御素蛋白编码基因设计引物，以合成的荞麦防御素蛋白编码基因为模版进行扩增；3)将步骤2)中扩增得到的基因片段克隆到表达载体中，构建重组质粒；4)将步骤3)中得到的重组质粒转化入大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，然后对重组大肠杆菌诱导表达，超声破碎收获重组荞麦防御素蛋白，利用亲和层析柱纯化后得到具有抗菌活性的重组荞麦防御素蛋白。优选的，所述步骤2)中所述引物包括上游引物F和下游引物R，所述上游引物F如SEQIDNO.5所示，所述下游引物R如SEQIDNO.6所示，具体如下：上游引物F：5’-GGATCCATAGGAACACATATG-3’,(SEQIDNO.5)；下游引物R：5’-CTCGAGACACGGCCTTTTGCAAACAC-3’,(SEQIDNO.6)。优选的，所述步骤2)中的具体扩增反应条件为：首先94℃预变性10分钟，再94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行32个循环，最后72℃延伸10分钟，反应结束后4℃保存。优选地，所述步骤3)所述基因片段克隆到表达载体中连接到BamHI和XhoI克隆位点。其中，所述的表达载体和宿主大肠杆菌都采用本领域常规的载体和宿主细胞，本领域技术人员可以根据需要选择不同的载体和宿主细胞，在此不做特殊限定，本专利技术采用pGEX6p-1表达载体和BL21(DE3)-plysS表达菌株。其中，诱导表达、超声破碎、亲和层析纯化等操作手段本领域技术人员都可以根据需要采用本领域公知的技术进行，在此不做特殊限定。进一步的，本专利技术还提供了一种如上所述的重组荞麦防御素蛋白、如上所述的DNA片段、如上所述的表达载体、如上所述的宿主细胞在制备抗真菌的药物、保健品、食品、化妆品和添加剂中的至少一种中的应用。优选的，所述真菌为黑曲霉、白腐霉或尖孢镰刀菌中的任一种。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术通过构建荞麦防御素蛋白的重组表达载体，利用原核重组表达技术获得GST融合的荞麦防御素蛋白，相较于表达包涵体再进行变性与复性的技术方案，本专利技术的重组表达技术方案简捷有效，且蛋白表达量相对较大，纯度较高(蛋白纯度达98％以上)，简单的生产及纯化方法为后续工业化生产及应用提供了保障。该蛋白对真菌有抑菌活性，在医疗保健，食品开发，化妆品研发等方面具有实用价值。附图说明图1为重组荞麦防御素的氨基酸序列信号肽的预测结果；图2为本专利技术重组荞麦防御素蛋白SDS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组荞麦防御素蛋白，其特征在于，所述重组荞麦防御素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种重组荞麦防御素蛋白，其特征在于，所述重组荞麦防御素蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。2.一种DNA片段，其特征在于，其包含编码权利要求1所述的重组荞麦防御素蛋白的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示。4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求2或3所述的DNA片段。5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求4所述的表达载体。6.一种如权利要求1所述的重组荞麦防御素蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)通过分析荞麦全基因序列筛选获得荞麦防御素蛋白的编码基因；2)根据荞麦防御素蛋白编码基因设计引物，以全合成的荞麦防御素蛋白编码基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：张新瑀，王转花，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西,14