一种用于粮食或饲料中T-2毒素检测的适配体生物传感器制备方法技术

本发明专利技术涉及用于粮食或饲料中T‑2毒素检测的适配体生物传感器的制备方法及应用，属于电化学检测技术领域。其特征在于：首先合成得到金纳米棒(Au NRs)材料，然后将铂还原在金纳米棒上，形成金铂纳米棒(Au@PtNRs)，通过与还原性氧化石墨烯‑四乙烯五胺(rGO‑TEPA)结合，实现了固载量的增加，提高了信号放大能力。再通过与单链DNA信号探针结合，从而制得生物信号探针；最终，通过二硫化钼‑聚苯胺‑壳聚糖‑金纳米粒子复合材料与DNA捕获探针的固定，从而制备了T‑2毒素检测的适配体传感器，该传感器成功地应用于粮食或饲料中T‑2毒素的痕量检测。本发明专利技术的优点在于其突破了T‑2毒素小分子物质的限制，通过引入核酸适配体，从而实现了T‑2毒素高灵敏度，高特异性的痕量检测。为霉菌毒素的检测提供了一种简便快捷的新策略。

Preparation of an aptamer biosensor for detection of T-2 toxin in food or feed

【技术实现步骤摘要】
一种用于粮食或饲料中T-2毒素检测的适配体生物传感器制备方法
：本专利技术涉及一种在粮食或饲料中定量检测T-2毒素的适配体传感器的制备方法及应用，利用T-2毒素能与其适配体特异性识别的机制，开发出核酸探针，并通过与还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺以及金铂纳米棒复合材料结合制备出信号探针，从而开发出新型适配体传感器用于检测粮食或饲料中的T-2毒素，属于电化学检测领域。
技术介绍
：T-2毒素是谷物、谷类产品以及动物饲料霉变过程中的镰刀菌(主要是拟枝孢镰刀菌)代谢产生的毒性最强的单端孢菌真菌毒素之一，它可造成人体多个功能系统损伤，严重危害生命健康，被欧洲食品安全局认为是食品中最危险的污染物之一。人畜误食被污染的谷物或饲料会引发多种急慢性中毒。急性中毒症状表现为呕吐和心血管功能障碍。慢性中毒症状表现为食欲不振、体重下降、口腔和食道病变等。通常人畜T-2毒素中毒是通过食用被污染的谷物或饲料低剂量长期暴露所致。另外，动物食用受污染的饲料会造成动物源性食品存在的毒素残留，也间接威胁着人类的健康。目前T-2毒素已在全球范围内广泛出现，而在我国谷物中的检出率已经达到了80％，早在1973年联合国粮农组织和世界卫生组织在日内瓦召开的联合会议上，就将这类毒素同黄曲霉素一样定为天然存在的最危险的食品污染源。因此，寻求一种快速简便且具有高灵敏度的T-2毒素检测方法，特别是提高对粮食或饲料中T-2毒素的痕量检测，对于保护消费者健康和提高现代检测技术水平具有重要意义。目前国内外T-2毒素的检测方法主要有液相色谱串联质谱法、超高效液相色谱-串联质谱法和气相色谱-串联质谱法等。但随着社会的进步和科技的发展，现代检测技术在国内外得到了突飞猛进的进步，近年来电化学技术由于其灵敏度高、稳定性好、操作简便、成本低、在复杂环境中能进行在线监测等特点，广泛应用于环境监测、生命科学、药物研究等各个方面。其中核酸适配体的发现为电化学检测技术添上了浓墨重彩的一笔，核酸适配体已被广泛运用于各种生物分子，有机无机离子等的特异性检测。因为其能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合，因此被广泛应用于生物传感器领域。当核酸适配体与目标物质发生特异性结合时，核酸适配体自身的构型会随之发生变化。目前研究者把核酸适配体应用于探针，开发了很多基于核酸适配体的构型变化的电化学传感器，与电化学检测方法的结合使之具备便携化、操作简单、成本低等特点。在检测技术的应用中，我们对目标物的检测通常达到了痕量标准，这就需要我们在电化学传感器的构建中提高检测的灵敏度并且降低检测限，设计合成出优异的电信号放大材料是实现这一目标的良好途径，另外也要以纳米材料为载体制备出具有识别和信号放大作用的纳米探针，放大标记物、增加电信号，从而实现低浓度分子的灵敏检测。随着纳米材料的发展，我们对纳米材料的要求不仅仅局限于性能的选择，也渐渐发展为要求特定的形状用以增大表面积、增大固载能力等方面。由此，各种形态、结构、尺寸以及成分可控的新型材料不断涌现。石墨烯纳米材料在作为信号修饰材料方面备受青睐。石墨烯是单层原子厚度的石墨，具有二维蜂窝状网格结构，各碳原子之间的连接非常柔韧，从而使碳原子不必重新排列也保持结构稳定。并且由于石墨烯片平面内π轨道的存在，电子可在晶体中自由移动，使得石墨烯具有十分优异的电子传输性能。还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺(rGO-TEPA)，是以石墨烯为基础的衍生物，通过氧化石墨烯与四乙烯五胺共价结合而成，除具有石墨烯的基本结构外，又增加了多种含氧官能团(如羟基、羧基)，使得氧化石墨烯更具有亲水性，有利于其在水中的分散以及其他物质的固载，同时也增加了大量的氨基可以直接吸附金属离子，基于上述优势，本项目拟利用还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺富含氨基且具有良好导电性、可以共价结合金属纳米粒子得有点，探索一种还原性氧化石墨烯-纳米金属复合材料作为信号放大策略。由于近年来双金属纳米粒子被广泛用于许多应用中并表现出完美的催化性能，对于双金属纳米粒子来说，其中一种金属可以具有长期稳定性和生物相容性，而另一种可以提供特定的电活性，包括电化学催化活性等，因此，金铂双金属纳米粒子由于其高催化活性，优异的生物相容性和良好的稳定性而被广泛用于电子领域。基于上述思考，我们通过实验首次合成了具有棒状形态的金铂纳米复合材料，棒状结构具有更大的表面积用于过氧化氢的催化，能够实现信号的有效放大，且通过与还原性氧化石墨烯的结合，实现了固载量的增加。另外，由于氨基标记信号探针能与我们的金铂纳米棒通过金属与氨基形成的金属键而牢固结合，所以具有足够大比表面积的还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺和金铂纳米棒组合成的新的纳米复合材料，不仅增大了信号探针的固载量，降低了检出限，也显著增强了我们的二次放大信号。因此，本项目基于还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺以及金铂纳米棒复合材料建立了一种新型分析方法检测粮食或饲料中的T-2毒素，通过T-2毒素核酸适配体的引入，开发出核酸探针，为粮食或饲料中T-2毒素的痕量检测提供了新的思路。
技术实现思路
：本专利技术针对上述提出的优势，提出了一种基于还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺以及金铂纳米棒复合材料信号探针的生物传感器，所述复合材料构建的适配体生物传感器可用于粮食或饲料中T-2毒素的检测，为粮食或饲料中T-2毒素的痕量检测提供新的思路。为了解决上述技术问题，成功制备出能实际用于粮食或饲料中T-2毒素的生物传感器，故本专利技术提出如下技术方案：还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺-金铂纳米棒-单链脱氧核糖核酸信号探针的制备，包括：1)制备金纳米颗粒；2)将步骤1)制得的金纳米颗粒加入到含有十六烷基三甲基溴化铵、抗坏血酸和硝酸银的溶液中，制得金纳米棒；3)将步骤2)制得的金纳米棒负载于还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺表面，获得还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺-金纳米棒复合材料；4)在步骤3)制得的还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺-金纳米棒复合材料的表面包履铂单质，形成还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺-金铂纳米棒复合材料5)将单链脱氧核糖核酸信号探针固载在于步骤4)所得的还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺-金铂纳米棒表面，得到还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺-金铂纳米棒-单链脱氧核糖核酸信号探针复合材料。所述步骤1)具体包括以下步骤：首先，在常温下将2.5mL浓度为0.5mM的氯金酸加入2.5mL浓度为0.2M的十六烷基三甲基溴化铵溶液中混合均匀，再加入300μL浓度为0.01M的硼氢化钠，快速混合2min，得到金粒溶液置于25℃备用。所述步骤2)具体包括以下步骤：首先将5mL浓度为0.2M的十六烷基三甲基溴化铵溶液与5mL浓度为1mM的氯金酸溶液混合均匀，加入0.15mL浓度为4mM的硝酸银溶液，反应5min，再加入70μL浓度为0.079M的抗坏血酸，反应2min，再加入12μL1)步骤准备的金粒，剧烈搅拌20s，保持25℃2小时，而后7000rpm离心30min，弃去上清，得到金纳米棒沉淀。所述步骤3)具体包括以下步骤：称取0.5mg的还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺溶于200μL浓度为20mM的十六烷基三甲基溴化铵溶液中，震荡均匀后将步骤2)得到的金纳米棒沉淀溶加入其中。所述步骤4)具体包括以下步骤：分别加入20μL浓度为10mM的氯铂酸、10μL浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于粮食或饲料中T‑2毒素检测的适配体生物传感器制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)还原性氧化石墨烯‑四乙烯五胺‑双金属金铂纳米棒‑单链脱氧核糖核酸信号探针的制备；2)建立适配体生物传感器，测定T‑2毒素，绘制标准曲线。

【技术特征摘要】
1.一种用于粮食或饲料中T-2毒素检测的适配体生物传感器制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺-双金属金铂纳米棒-单链脱氧核糖核酸信号探针的制备；2)建立适配体生物传感器，测定T-2毒素，绘制标准曲线。2.根据权利要求1所述还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺-双金属金铂纳米棒-单链脱氧核糖核酸信号探针的制备过程，其特征包括以下步骤：1)制备金纳米颗粒；2)将步骤1)制得的金纳米颗粒加入到含有十六烷基三甲基溴化铵、抗坏血酸和硝酸银的溶液中，制得金纳米棒；3)将步骤2)制得的金纳米棒负载于还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺表面，获得还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺-金纳米棒复合材料；4)在步骤3)制得的还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺-金纳米棒复合材料的表面包履铂单质，形成还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺-金铂纳米棒复合材料5)将单链脱氧核糖核酸信号探针固载在于步骤4)所得的还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺-金铂纳米棒表面，得到还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺-金铂纳米棒-单链脱氧核糖核酸信号探针复合材料。3.根据权利要求2步骤1)所述，其特征在于包括以下步骤：首先，在常温下将2.5mL浓度为0.5mM的氯金酸加入2.5mL浓度为0.2M的十六烷基三甲基溴化铵溶液中混合均匀，再加入300μL浓度为0.01M的硼氢化钠，快速混合2min，得到金粒溶液置于25℃备用。4.根据权利要求2步骤2)所述，其特征在于包括以下步骤：首先将5mL浓度为0.2M的十六烷基三甲基溴化铵溶液与5mL浓度为1mM的氯金酸溶液混合均匀，加入0.15mL浓度为4mM的硝酸银溶液，反应5min，再加入70μL浓度为0.079M的抗坏血酸，反应2min，再加入12μL1)步骤准备的金粒，剧烈搅拌20s，保持25℃2小时，而后7000rpm离心30min，弃去上清，得到金纳米棒沉淀。5.根据权利要求2步骤3)所述，其特征在于包括以下步骤：称取0.5mg的还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺溶于200μL浓度为20mM的十六烷基三甲基溴化铵溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：何俊琳，于超，钟航天，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50